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摘要 目的：利用HPLC法测定尿素维E乳膏中的尿素含量。方法：色谱柱为Sepax HP-Silica（4.6×250mm， 5μm），流动相为乙腈-0.1%甲酸水（97.5：2.5），采用等度洗脱，流速为1ml/min，检测波长为195nm，柱温为30℃，进样体积为10μl。结果：尿素在0.099064mg/ml～0.792512mg/ml浓度范围内，呈良好的线性关系（R? =0.9999）。尿素回收率为100.03%～100.97%。结论：该方法专属性好，灵敏度高，定量准确，可用于尿素维E乳膏中尿素含量测定。
【中图分类号】R453 【文献标识码】A 【文章编号】2026-5328（2021）05-105-02
Abstract Objective： To determine the urea content of Urea vitamin E Cream by HPLC. Methods：The determination was performed on Sepax HP-Silica column （4.6×250mm， 5μm） with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% formic acid water （97.5：2.5）. The flow rate was 1 mL /min. The detection wavelength was set at 195nm. Results： Urea showed a good linear relationship in the concentration range of 0.099064mg/ mL ～0.792512mg/ mL （R? =0.9999）. The urea recovery was 100.03%-100.97%.Conclusions：The method has good specificity， high sensitivity and accurate quantification， and can be used for the determination of urea content in Urea Vitamin E Cream.
尿素維E乳膏是皮肤外用制剂，临床用于手、足皲裂，对角化型手足癣引起的皲裂也有效[1]。在八十年代初进入市场以来，尿素维E乳膏因具有起效迅速、疗效确切等优点，长期使用无毒副作用，安全可靠，深受广大患者的青睐，已成为广泛使用的皮肤科药品之一。尿素维E乳膏是一种复方制剂，其有效成分为尿素（15%）和维生素E（1%）。在《中国药典》2020年版二部[2]方法测定中有关尿素含量的测定方法有薄层色谱法和紫外分光光度法，文献中也多是紫外分光光度法的测定尿素含量[3-5]，但紫外分光光度法准确度不高，测定结果重现性差，因此本方法参照USP42尿素、胶囊、口服液等标准，结合产品本身特点而建立专属性强、灵敏度高、重复性好、操作简便的高效液相色谱（HPLC）法。
1 仪器与试药
1.1仪器
Ultimate U3000型高效液相色谱仪，包括自动进样器、紫外分光广度检测器、Chromeleon6.8软件（美国Thermo Fisher公司）;KQ3200型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）。
1.2试药
尿素维E乳膏（广东华润顺峰药业有限公司，批号：20190002、20190003、20190004，规格：25克：尿素3.75克与维生素E 0.25克）;尿素对照品（批号：100288-201302，纯度：100.0%），购自中国食品药品检定研究院;甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱是Sepax HP-Silica柱（4.6×250mm， 5μm），流动相为乙腈-0.1%甲酸水（97.5：2.5），以乙腈-水（9：1）为溶剂，采用等度洗脱，流速为1ml/min，检测波长为195nm，柱温为30℃，进样体积为10μl。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液
取尿素对照品25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加溶剂适量超声使溶解，并稀释至刻度，摇匀。
2.2.2 供试品溶液
取本品适量（约相当于尿素25mg），精密称定，置50ml量瓶中，加溶剂适量，置60-70℃水浴中加热振摇，使尿素溶解，放冷至室温，加溶剂稀释至刻度，摇匀，置冰浴中冷却30min以上，取出迅速滤过，弃去初滤液，取续滤液放至室温即得。
2.2.3阴性样品溶液
称取尿素维E乳膏不含尿素的阴性样品0.25g，精密称定，置50ml量瓶中，加溶剂适量，置60-70℃水浴中加热振摇，使尿素溶解，放冷至室温，加溶剂稀释至刻度，摇匀，置冰浴中冷却30min以上，取出迅速滤过，弃去初滤液，取续滤液放至室温即得。
2.3系统适应性试验
精密量取“2.2”项下对照品溶液，连续进样6次，注入液相色谱仪，记录色谱图，主峰峰面积的RSD为0.18%，拖尾因子约为0.91，理论板数按尿素峰计算大于4000，系统适应性良好。
2.4 线性关系考察
取尿素对照品约500mg，精密称定，置于100ml容量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。分别精密量取对照品储备液各1ml、2ml、3ml、5ml、6ml、8ml，置50ml容量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，分别作为待测溶液。取待测溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，以浓度为X轴，峰面积为Y轴，作线性回归。尿素的线性方程为：y = 52.233x + 0.1558，r=0.9999，线性考察范围为：99.064～792.512μg/ml。 2.5 精密度试验
2.5.1 重复性试验
取本品适量（约相当于尿素25mg），平行称取6份，按尿素含量测定方法操作，测得含量为100.8%，RSD为0.31%，说明方法重复性良好。
2.5.2 中间精密度
与重复性试验同法操作，在不同时间，用不同儀器测定，两个实验人员测定的含量平均值为101.1%，RSD为0.56%，说明方法中间精密度良好。
2.6 稳定性试验
取供试品溶液和对照品溶液于室温下放置0、2、4、6、8、10、12、14、16、18和20h后，各精密量取10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图。供试品溶液和对照品溶液峰面积的RSD分别为0.45%和0.72%，溶液稳定性良好。
2.7 回收率试验
按照处方称取阴性样品9份，置50ml容量瓶中，分别精密量取尿素对照品储备液（约5mg/ml）各4ml、5ml、6ml，加溶剂适量，在60-70℃水浴加热使尿素溶解，放冷，用溶剂稀释至刻度，摇匀，置冰浴中冷却30min以上，取出迅速滤过，弃去初滤液，取续滤液放至室温即得高、中、低三个浓度各三份溶液，分别按样品含量测定方法操作，计算回收率，结果尿素的平均回收率为100.6%（RSD为0.26%）。
2.8样品含量测定
对3批工艺验证批样品进行尿素含量检测，结果见表1。
3 讨论（主要讲下方法摸索点）
以往常用的尿素检测方法或操作步骤烦琐，或专属性差，结果往往不够理想。随着液相色谱技术的发展和先进仪器设备的引入，以及近年来先进色谱理论指导，本实验尝试采用色谱柱为Sepax HP-Silica（4.6×250mm， 5μm），流动相为乙腈-0.1%甲酸水（97.5：2.5），采用等度洗脱，对尿素进行检测分析。经验证，本方法灵敏度高、定量准确、专属性强，可用于尿素维e乳膏中尿素含量的测定。
参考文献
[1]中华人民共和国卫生部药政局编.《中国医院制剂规范》西药制剂第二版[M]，中国医药科技出版社，140-141.
[2]国家药典委员会，中华人民共和国药典（ 二部） [M].北京：化学工业出版社，2020： 652.
[3]刘炜，孙颖，曾蔚欣，紫外分光光度法测定尿素乳膏中尿素的含量[J]，天津药学，2011，23（ 6）：20-21.
[4]徐凤梅，紫外分光光度法测定尿素乳膏含量[J].天津药学.2002（02）
[5]邓昌国，童丽健等，维生素E乳膏剂质量标准的研制[J]，中国现代应用药学，2008，25（8）：709-710.
广东华润顺峰药业有限公司 528300
【中图分类号】R453 【文献标识码】A 【文章编号】2026-5328（2021）05-105-02
Abstract Objective： To determine the urea content of Urea vitamin E Cream by HPLC. Methods：The determination was performed on Sepax HP-Silica column （4.6×250mm， 5μm） with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% formic acid water （97.5：2.5）. The flow rate was 1 mL /min. The detection wavelength was set at 195nm. Results： Urea showed a good linear relationship in the concentration range of 0.099064mg/ mL ～0.792512mg/ mL （R? =0.9999）. The urea recovery was 100.03%-100.97%.Conclusions：The method has good specificity， high sensitivity and accurate quantification， and can be used for the determination of urea content in Urea Vitamin E Cream.
尿素維E乳膏是皮肤外用制剂，临床用于手、足皲裂，对角化型手足癣引起的皲裂也有效[1]。在八十年代初进入市场以来，尿素维E乳膏因具有起效迅速、疗效确切等优点，长期使用无毒副作用，安全可靠，深受广大患者的青睐，已成为广泛使用的皮肤科药品之一。尿素维E乳膏是一种复方制剂，其有效成分为尿素（15%）和维生素E（1%）。在《中国药典》2020年版二部[2]方法测定中有关尿素含量的测定方法有薄层色谱法和紫外分光光度法，文献中也多是紫外分光光度法的测定尿素含量[3-5]，但紫外分光光度法准确度不高，测定结果重现性差，因此本方法参照USP42尿素、胶囊、口服液等标准，结合产品本身特点而建立专属性强、灵敏度高、重复性好、操作简便的高效液相色谱（HPLC）法。
1 仪器与试药
1.1仪器
Ultimate U3000型高效液相色谱仪，包括自动进样器、紫外分光广度检测器、Chromeleon6.8软件（美国Thermo Fisher公司）;KQ3200型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）。
1.2试药
尿素维E乳膏（广东华润顺峰药业有限公司，批号：20190002、20190003、20190004，规格：25克：尿素3.75克与维生素E 0.25克）;尿素对照品（批号：100288-201302，纯度：100.0%），购自中国食品药品检定研究院;甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱是Sepax HP-Silica柱（4.6×250mm， 5μm），流动相为乙腈-0.1%甲酸水（97.5：2.5），以乙腈-水（9：1）为溶剂，采用等度洗脱，流速为1ml/min，检测波长为195nm，柱温为30℃，进样体积为10μl。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液
取尿素对照品25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加溶剂适量超声使溶解，并稀释至刻度，摇匀。
2.2.2 供试品溶液
取本品适量（约相当于尿素25mg），精密称定，置50ml量瓶中，加溶剂适量，置60-70℃水浴中加热振摇，使尿素溶解，放冷至室温，加溶剂稀释至刻度，摇匀，置冰浴中冷却30min以上，取出迅速滤过，弃去初滤液，取续滤液放至室温即得。
2.2.3阴性样品溶液
称取尿素维E乳膏不含尿素的阴性样品0.25g，精密称定，置50ml量瓶中，加溶剂适量，置60-70℃水浴中加热振摇，使尿素溶解，放冷至室温，加溶剂稀释至刻度，摇匀，置冰浴中冷却30min以上，取出迅速滤过，弃去初滤液，取续滤液放至室温即得。
2.3系统适应性试验
精密量取“2.2”项下对照品溶液，连续进样6次，注入液相色谱仪，记录色谱图，主峰峰面积的RSD为0.18%，拖尾因子约为0.91，理论板数按尿素峰计算大于4000，系统适应性良好。
2.4 线性关系考察
取尿素对照品约500mg，精密称定，置于100ml容量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。分别精密量取对照品储备液各1ml、2ml、3ml、5ml、6ml、8ml，置50ml容量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，分别作为待测溶液。取待测溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，以浓度为X轴，峰面积为Y轴，作线性回归。尿素的线性方程为：y = 52.233x + 0.1558，r=0.9999，线性考察范围为：99.064～792.512μg/ml。 2.5 精密度试验
2.5.1 重复性试验
取本品适量（约相当于尿素25mg），平行称取6份，按尿素含量测定方法操作，测得含量为100.8%，RSD为0.31%，说明方法重复性良好。
2.5.2 中间精密度
与重复性试验同法操作，在不同时间，用不同儀器测定，两个实验人员测定的含量平均值为101.1%，RSD为0.56%，说明方法中间精密度良好。
2.6 稳定性试验
取供试品溶液和对照品溶液于室温下放置0、2、4、6、8、10、12、14、16、18和20h后，各精密量取10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图。供试品溶液和对照品溶液峰面积的RSD分别为0.45%和0.72%，溶液稳定性良好。
2.7 回收率试验
按照处方称取阴性样品9份，置50ml容量瓶中，分别精密量取尿素对照品储备液（约5mg/ml）各4ml、5ml、6ml，加溶剂适量，在60-70℃水浴加热使尿素溶解，放冷，用溶剂稀释至刻度，摇匀，置冰浴中冷却30min以上，取出迅速滤过，弃去初滤液，取续滤液放至室温即得高、中、低三个浓度各三份溶液，分别按样品含量测定方法操作，计算回收率，结果尿素的平均回收率为100.6%（RSD为0.26%）。
2.8样品含量测定
对3批工艺验证批样品进行尿素含量检测，结果见表1。
3 讨论（主要讲下方法摸索点）
以往常用的尿素检测方法或操作步骤烦琐，或专属性差，结果往往不够理想。随着液相色谱技术的发展和先进仪器设备的引入，以及近年来先进色谱理论指导，本实验尝试采用色谱柱为Sepax HP-Silica（4.6×250mm， 5μm），流动相为乙腈-0.1%甲酸水（97.5：2.5），采用等度洗脱，对尿素进行检测分析。经验证，本方法灵敏度高、定量准确、专属性强，可用于尿素维e乳膏中尿素含量的测定。
参考文献
[1]中华人民共和国卫生部药政局编.《中国医院制剂规范》西药制剂第二版[M]，中国医药科技出版社，140-141.
[2]国家药典委员会，中华人民共和国药典（ 二部） [M].北京：化学工业出版社，2020： 652.
[3]刘炜，孙颖，曾蔚欣，紫外分光光度法测定尿素乳膏中尿素的含量[J]，天津药学，2011，23（ 6）：20-21.
[4]徐凤梅，紫外分光光度法测定尿素乳膏含量[J].天津药学.2002（02）
[5]邓昌国，童丽健等，维生素E乳膏剂质量标准的研制[J]，中国现代应用药学，2008，25（8）：709-710.
广东华润顺峰药业有限公司 528300