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【摘 要】朊蛋白病变是疯牛病等疾病的根本原因，但是其病变机理仍不是很清楚。本文采用分子模拟的方法，初步探讨了朊蛋白分子之间的自沉聚机理。结果显示，朊蛋白分子内主要存在三种活泼基团，分别为 -OH， -NH2和-COO-。它们之间主要通过水桥氢键的作用完成自沉聚过程。一般而言，形成水桥氢键的水分子数目不会超过三个。
【关键词】朊蛋白；自沉聚；分子模拟
一、前言
朊蛋白是人和动物中存在的由正常细胞基因编码的产物，在正常状况下处于“细胞形态”（“cellular form”），简称PrPc，本身不能致病；而导致疾病的是处于“搔痒形态”（“scrapie form”） 的朊病毒蛋白，简称PrPSc。至于其致病机理，现在广泛接受的说法是，朊病毒发生了自沉聚[1，2]。研究表明，在朊病毒蛋白PrPSc的影响下，PrPc会很快转化成PrPSc蛋白分子，且此过程是不可逆的，随后PrPSc分子发生自沉聚，形成高级寡聚体[3，4]，从而引起病变。需要注意的是，正常的PrPC蛋白也会相互聚集，问题就在于，为什么正常的朊蛋白分子自沉聚后可以分解，而致病的朊病毒蛋白自沉聚后很难分解？为了解决这个问题，本文初步探讨了朊蛋白分子之间的自沉聚机理。
本文所采用的方法主要是 MD模拟和SMD模拟。MD模拟现在已经被广泛应用于研究分子尺度上的相互作用，并以此来讨论蛋白质吸附行为的表面化学效应[5，6]。但是，MD模拟只能局限于纳米时间尺度，对于相对长时间尺度的动力学行为则显得力不从心[7]。因此，在本文中我们同时还采用了SMD[8]模拟的方法。这种方法通过在特定的方向上施加外力，从而大大加速了我们所要研究的动力学过程。SMD模拟的方法已经被证明是一种行之有效的方法来较大时间尺度的生物大分子体系的动力学行为，并且该方法已经成为生物体外单分子实验的有效补充手段。
二、模拟细节
朊病毒的初始构型来自于蛋白质数据库（http：//www.rcsb.org/pdb/， ID = 1LG4）。首先，将从数据库下载得到的两个PrPc分子置于水环境之中，进行1ns的平衡模拟，从而得到其平衡构型。考虑到PrPc带有负电荷，体系中加入了4个Na+离子使体系保持电中性。同时，Na+离子也使模拟体系更接近于生物体液环境。然后，以前面所得到的平衡构型为基础，构建由两个PrPc分子组成的模拟体系。将此体系置于66.0×40.8×170.0 ?3（7836个水分子）的水环境中进行 2ns 的MD平衡模拟，得到该体系的稳定构型。在模拟中，我们采用NAMD[9]软件包和Charmm27[10]力场。所有的水分子都采用SPC 模型。最后，在以上2ns 的MD模拟结果的基础上，进行了1ns的SMD模拟。
三、结果与讨论
（一）吸附平衡模拟
对所研究的生物体系进行MD模拟以获得其平衡构型是非常必要的。本文中主要采用了三种判据，即蛋白质的势能，蛋白质的回旋半徑和蛋白质骨架原子的均方根差（图1-图3）。因为2ns 的MD模拟给出了太多的数据，为简便明了起见，图中只列出了最后关键的1 ns的朊蛋白分子的势能曲线。在整个的模拟过程中，PrPc的三维结构基本没有发生变化，这很好地体现了生物分子在构型方面的稳定性，从而维持其一定的生物学功能。
如图1所示，分子的势能曲线在最后的1ns中，波动一直都很小，总是围绕着-1950 kcal·mol-1上下波动，这充分说明所研究的体系已经达到了平衡状态。同样，在图2的回旋半径曲线中，最后的1ns，分子回旋半径波动很小，大概在14.8左右，波幅几乎恒定，说明所要研究的体系达到平衡。图3的RMSD曲线也显示了同样的信息：最后1ns的RMSD数值波动很小，在1.4左右上下波动，这说明此体系已经达到了平衡。
图1 朊蛋白双聚分子的势能-时间变化曲线
图2 朊蛋白双聚分子的回旋半径-时间变化曲线
图3 朊蛋白双聚分子的RMSD-时间变化曲线
（二）PrPc双分子的自沉聚机理
为了细致地研究PrPc间的作用机理，在前面得到的平衡结构的基础上，又进行了1 ns的SMD模拟。该SMD模拟过程中的代表性状态列于下图中。通过分析该过程的运动轨迹可以很清楚地看到PrPc的沉聚是一个逐步的过程。开始时，两个PrPc分子之间没有相互作用的残基。所以对之施加外力。尽管此时也有一些基团相互靠近，但是它们并没有自沉聚现象。由于人为施加的外力以及蛋白质周围大量水分子的作用， PrPc分子会不断振动以期达到与另一PrPc分子之间最强的相互作用。本文记录了整个SMD模拟过程中，两个PrPc分子之间的相互作用力曲线见图4。由图4可见，当分子间距（DOMC）约为3～4 ?时，两个PrPc分子之间显示出最强相互作用力，其大小约为4500 pN，说明此距离下，两个PrPc分子结合的最牢固。随着分子间距不断增大，PrPc分子之间的相互作用力越来越弱。因此，两分子间距5 ?以内是研究重点。此外，当DOMC分别为18 ?和26 ?时，分子间作用力也出现峰值，说明此时，两个PrPc分子之间也存在一定的相互作用。那么，哪些基团导致了这些明显的相互作用？其相互作用本质如何？图5-6中给出了具体的相互作用模拟细节。
图4 PrPc双分子间的相互作用力曲线
图5 两个PrPc分子相互作用cartoon图示
图6 PrPc分子相互作用中的水桥氢键图示
图5中显示的是以cartoon形式表示的参与研究的两个相互作用的PrPc蛋白质分子，不同的颜色表示不同的氨基酸残基，图中的两个球棍模型表示的残基是参与两个PrPc相互作用的残基。模拟结果显示，朊蛋白分子内主要存在三种活泼基团，分别为 -OH， -NH2和-COO-。它们之间主要通过水桥氢键的作用完成自沉聚过程。如图6所示，两个相互作用残基之间通过一个水分子的桥梁作用形成相互作用。因为生物体中水分子大量存在，因此水桥氢键将在生物体中广泛存在，因此相关现象应引起广大研究者的充分重视。综合整个模拟过程，一般而言，形成水桥氢键的水分子数目不会超过三个。一旦超过3个，蛋白质分子相互作用部分距离太远，其相互作用力较弱，形成的体系不会稳定存在。 四、本章小结
本文采用MD、SMD模拟的方法讨论了朊蛋白分子之间的相互作用。结果表明，SMD模拟可以从原子尺度很好的展现蛋白质分子之间的微观相互作用细节。对于本文所研究的两个朊蛋白分子，模拟发现存在三种活泼基团，分别为-OH， -NH2和-COO-，它们在PrPc分子中往往与强吸电子基团（例如-C=O）毗邻。它们之间的相互作用主要是通过水桥氢键完成的。一般而言，形成水桥氢键的水分子数目不会超过三个。众所周知，所有重要的生命物质都含有氢，并且通过形成氢键在各种生命进程里发生作用。另外，生命体系是一个水溶液体系，所有的生化反应都是在水中进行，而这些反应一般都涉及到与水分子之间的氢键。因此，生物大分子之间的相互作用，一般都涉及到氢键的形成，特别是生物分子之间的结合一般都是可逆结合，而氢键这种强度适中的作用，正适合于这种结合。本文所采用的分子模拟的方法，为生物体系相关研究提供了一种新的研究思路，该方法在较大时间尺度的生物大分子体系的动力学行为研究方面得到了广泛的应用，已经成为生物体外单分子实验的有效补充手段。
参考文献：
[1] Mange A， Nishhida N， Milhawet O， et al. Cultures J Virol， 2000，74 （7）：315-3140.
[2] Weissmann C. J Biological Chemistry， 1999， 274 （1）：3-6.
[3] Safar J， Roller PP， Gejdusek DC， et a1. Protein Sci， 1993， 2， 2206-2216.
[4] Nelson R， Sawaya MR， Balbimie M， et a1. Nature. 2005， 435， 773-778.
[5] Becker OM， Jr. MacKerell AD， Roux B， Watanabe M. Computational Biochemistry and Biophysics， Marcel Dekker， New York. 2001.
[6] Bhowmik R， Katti KS， Katti D. Polymer 2007， 48， 664-674.
[7] Park S， Schulten K. J. Chem. Phys. 2004， 13， 5946-5961.
[8] Lu H， Schulten K. Biophys. J. 2000， 79：51-65.
[9] Kale L， Skeel R， Bhandarkar M， et al. J. Comp. Phys. 1999， 151：283-312.
[10] MacKerell A D， Jr Bashford D， Bellott R L， et al. J. Phys. Chem. B. 1998， 102：3586-3616.
基金項目：
本课题来源于山东省高校科技计划项目，基金项目编号J10LC80。
作者简介：
董秀丽（1979.07），女，山东烟台，毕业于浙江大学，现从事于化学教学。
【关键词】朊蛋白；自沉聚；分子模拟
一、前言
朊蛋白是人和动物中存在的由正常细胞基因编码的产物，在正常状况下处于“细胞形态”（“cellular form”），简称PrPc，本身不能致病；而导致疾病的是处于“搔痒形态”（“scrapie form”） 的朊病毒蛋白，简称PrPSc。至于其致病机理，现在广泛接受的说法是，朊病毒发生了自沉聚[1，2]。研究表明，在朊病毒蛋白PrPSc的影响下，PrPc会很快转化成PrPSc蛋白分子，且此过程是不可逆的，随后PrPSc分子发生自沉聚，形成高级寡聚体[3，4]，从而引起病变。需要注意的是，正常的PrPC蛋白也会相互聚集，问题就在于，为什么正常的朊蛋白分子自沉聚后可以分解，而致病的朊病毒蛋白自沉聚后很难分解？为了解决这个问题，本文初步探讨了朊蛋白分子之间的自沉聚机理。
本文所采用的方法主要是 MD模拟和SMD模拟。MD模拟现在已经被广泛应用于研究分子尺度上的相互作用，并以此来讨论蛋白质吸附行为的表面化学效应[5，6]。但是，MD模拟只能局限于纳米时间尺度，对于相对长时间尺度的动力学行为则显得力不从心[7]。因此，在本文中我们同时还采用了SMD[8]模拟的方法。这种方法通过在特定的方向上施加外力，从而大大加速了我们所要研究的动力学过程。SMD模拟的方法已经被证明是一种行之有效的方法来较大时间尺度的生物大分子体系的动力学行为，并且该方法已经成为生物体外单分子实验的有效补充手段。
二、模拟细节
朊病毒的初始构型来自于蛋白质数据库（http：//www.rcsb.org/pdb/， ID = 1LG4）。首先，将从数据库下载得到的两个PrPc分子置于水环境之中，进行1ns的平衡模拟，从而得到其平衡构型。考虑到PrPc带有负电荷，体系中加入了4个Na+离子使体系保持电中性。同时，Na+离子也使模拟体系更接近于生物体液环境。然后，以前面所得到的平衡构型为基础，构建由两个PrPc分子组成的模拟体系。将此体系置于66.0×40.8×170.0 ?3（7836个水分子）的水环境中进行 2ns 的MD平衡模拟，得到该体系的稳定构型。在模拟中，我们采用NAMD[9]软件包和Charmm27[10]力场。所有的水分子都采用SPC 模型。最后，在以上2ns 的MD模拟结果的基础上，进行了1ns的SMD模拟。
三、结果与讨论
（一）吸附平衡模拟
对所研究的生物体系进行MD模拟以获得其平衡构型是非常必要的。本文中主要采用了三种判据，即蛋白质的势能，蛋白质的回旋半徑和蛋白质骨架原子的均方根差（图1-图3）。因为2ns 的MD模拟给出了太多的数据，为简便明了起见，图中只列出了最后关键的1 ns的朊蛋白分子的势能曲线。在整个的模拟过程中，PrPc的三维结构基本没有发生变化，这很好地体现了生物分子在构型方面的稳定性，从而维持其一定的生物学功能。
如图1所示，分子的势能曲线在最后的1ns中，波动一直都很小，总是围绕着-1950 kcal·mol-1上下波动，这充分说明所研究的体系已经达到了平衡状态。同样，在图2的回旋半径曲线中，最后的1ns，分子回旋半径波动很小，大概在14.8左右，波幅几乎恒定，说明所要研究的体系达到平衡。图3的RMSD曲线也显示了同样的信息：最后1ns的RMSD数值波动很小，在1.4左右上下波动，这说明此体系已经达到了平衡。
图1 朊蛋白双聚分子的势能-时间变化曲线
图2 朊蛋白双聚分子的回旋半径-时间变化曲线
图3 朊蛋白双聚分子的RMSD-时间变化曲线
（二）PrPc双分子的自沉聚机理
为了细致地研究PrPc间的作用机理，在前面得到的平衡结构的基础上，又进行了1 ns的SMD模拟。该SMD模拟过程中的代表性状态列于下图中。通过分析该过程的运动轨迹可以很清楚地看到PrPc的沉聚是一个逐步的过程。开始时，两个PrPc分子之间没有相互作用的残基。所以对之施加外力。尽管此时也有一些基团相互靠近，但是它们并没有自沉聚现象。由于人为施加的外力以及蛋白质周围大量水分子的作用， PrPc分子会不断振动以期达到与另一PrPc分子之间最强的相互作用。本文记录了整个SMD模拟过程中，两个PrPc分子之间的相互作用力曲线见图4。由图4可见，当分子间距（DOMC）约为3～4 ?时，两个PrPc分子之间显示出最强相互作用力，其大小约为4500 pN，说明此距离下，两个PrPc分子结合的最牢固。随着分子间距不断增大，PrPc分子之间的相互作用力越来越弱。因此，两分子间距5 ?以内是研究重点。此外，当DOMC分别为18 ?和26 ?时，分子间作用力也出现峰值，说明此时，两个PrPc分子之间也存在一定的相互作用。那么，哪些基团导致了这些明显的相互作用？其相互作用本质如何？图5-6中给出了具体的相互作用模拟细节。
图4 PrPc双分子间的相互作用力曲线
图5 两个PrPc分子相互作用cartoon图示
图6 PrPc分子相互作用中的水桥氢键图示
图5中显示的是以cartoon形式表示的参与研究的两个相互作用的PrPc蛋白质分子，不同的颜色表示不同的氨基酸残基，图中的两个球棍模型表示的残基是参与两个PrPc相互作用的残基。模拟结果显示，朊蛋白分子内主要存在三种活泼基团，分别为 -OH， -NH2和-COO-。它们之间主要通过水桥氢键的作用完成自沉聚过程。如图6所示，两个相互作用残基之间通过一个水分子的桥梁作用形成相互作用。因为生物体中水分子大量存在，因此水桥氢键将在生物体中广泛存在，因此相关现象应引起广大研究者的充分重视。综合整个模拟过程，一般而言，形成水桥氢键的水分子数目不会超过三个。一旦超过3个，蛋白质分子相互作用部分距离太远，其相互作用力较弱，形成的体系不会稳定存在。 四、本章小结
本文采用MD、SMD模拟的方法讨论了朊蛋白分子之间的相互作用。结果表明，SMD模拟可以从原子尺度很好的展现蛋白质分子之间的微观相互作用细节。对于本文所研究的两个朊蛋白分子，模拟发现存在三种活泼基团，分别为-OH， -NH2和-COO-，它们在PrPc分子中往往与强吸电子基团（例如-C=O）毗邻。它们之间的相互作用主要是通过水桥氢键完成的。一般而言，形成水桥氢键的水分子数目不会超过三个。众所周知，所有重要的生命物质都含有氢，并且通过形成氢键在各种生命进程里发生作用。另外，生命体系是一个水溶液体系，所有的生化反应都是在水中进行，而这些反应一般都涉及到与水分子之间的氢键。因此，生物大分子之间的相互作用，一般都涉及到氢键的形成，特别是生物分子之间的结合一般都是可逆结合，而氢键这种强度适中的作用，正适合于这种结合。本文所采用的分子模拟的方法，为生物体系相关研究提供了一种新的研究思路，该方法在较大时间尺度的生物大分子体系的动力学行为研究方面得到了广泛的应用，已经成为生物体外单分子实验的有效补充手段。
参考文献：
[1] Mange A， Nishhida N， Milhawet O， et al. Cultures J Virol， 2000，74 （7）：315-3140.
[2] Weissmann C. J Biological Chemistry， 1999， 274 （1）：3-6.
[3] Safar J， Roller PP， Gejdusek DC， et a1. Protein Sci， 1993， 2， 2206-2216.
[4] Nelson R， Sawaya MR， Balbimie M， et a1. Nature. 2005， 435， 773-778.
[5] Becker OM， Jr. MacKerell AD， Roux B， Watanabe M. Computational Biochemistry and Biophysics， Marcel Dekker， New York. 2001.
[6] Bhowmik R， Katti KS， Katti D. Polymer 2007， 48， 664-674.
[7] Park S， Schulten K. J. Chem. Phys. 2004， 13， 5946-5961.
[8] Lu H， Schulten K. Biophys. J. 2000， 79：51-65.
[9] Kale L， Skeel R， Bhandarkar M， et al. J. Comp. Phys. 1999， 151：283-312.
[10] MacKerell A D， Jr Bashford D， Bellott R L， et al. J. Phys. Chem. B. 1998， 102：3586-3616.
基金項目：
本课题来源于山东省高校科技计划项目，基金项目编号J10LC80。
作者简介：
董秀丽（1979.07），女，山东烟台，毕业于浙江大学，现从事于化学教学。