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摘要：采用二硝基水杨酸法（DNS法）分别对8种大型食用真菌菌糠浸提液的产木聚糖酶的能力进行检测，最终确定：元蘑产木聚糖酶能力最强，酶活为406.98IU/g。黑木耳LK8产木聚糖酶能力次之，酶活为384.2IU/g。平菇产木聚糖酶能力最弱，酶活为192.05IU/g。综合看来，食用菌真菌产木聚糖酶能力较强，其菌糠残留木聚糖酶活较高。适合用来浸提提取粗含木聚糖酶的粗酶制剂。
关键词：木聚糖酶；食用真菌；废弃菌糠；浸提
木聚糖酶（xylanase）是一类能够损坏植物纤维组织，降解半纤维素，其主要成分为木聚糖的一组酶的总称，是具有可诱导性的。木聚糖酶已被广泛应用于工业生产，动物饲料饲喂，食品加工添加，能源开发，环境治理，造纸行业以及功能性低聚糖制备等领域，同时，还可为食用菌优质品种选育及分析归类提供重要参考[1]。木聚糖酶产生菌来源目前主要通过以下几个方法，自然菌株的筛选，或通过诱变、蛋白质工程、以及基因工程等分子技术改造产酶基因。目前国内主流研究主要集中在利用工程化菌株来生产木聚糖酶，其中青霉、木霉、黑曲霉、链霉菌、酵母菌[2]等研究比较多。利用废弃菌糠浸提液提取木聚糖酶进行研究，从8种大型食用真菌废弃菌糠中筛选产木聚糖酶能力较强的真菌种类，为木聚糖酶生产提供基础的研究数据和相关参考资料，为实际生产中产生的大量菌糠进行再利用，从而创造经济价值与环境价值提供参考。
黑龙江省伊春市以2010年为例，伊春黑木耳栽培量5.1亿袋，产销量巨大，年产菌糠50万吨，然而，这大量的菌糠并没有企业或工厂能够进行生产利用，主要的处理方式即简单的原地堆砌、焚烧或掩埋，造成了严重的空气、土壤、水源的污染，如果能够成功回收废弃的菌糠对其进行在利用，将可获得经济上及环境保护治理方面的双重重大意义。
1材料与方法
1.1实验材料
8种（4株木耳、1株平菇、1株金针菇、1株元蘑、1株猴头菇）食用真菌菌糠为实验对象。（菌糠来源伊春本地菌户养殖的食用菌品种的废弃菌袋）
1.2药品试剂与仪器设备
1、主要药品
木聚糖、木糖、羧甲基纤维素钠、可溶性淀粉、酒石酸钾钠、水杨酸、苯酚等多数药品购自上海生工生物公司，药品多为国产分析纯。
2、主要仪器设备
LS-B75L立式压力蒸汽灭菌器，TDL5M台式高速离心机，HH-BLL电热恒温培养箱，U3010可见紫外分光光计，
Zd-85气浴恒温振荡器，AL104电子天平，DELTA320 pH计，JHI-SS超净工作台。
1.3主要试剂的配置
1.31底物的配置
（1）0.5%CMC-Na 溶液：取 0.5gCMC-Na 定溶于 100mL 的 pH4.6、0.1M 柠檬酸缓冲液。
（2）0.5%木聚糖溶液：取0.5g木聚糖定溶于100mL pH4.6、0.2M 乙酸缓冲液。
（3）0.5%可溶性淀粉：取0.5g可溶性淀粉定溶于100mL pH5.8、0.2M 乙酸缓冲液。
1.3.2 3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂的配置
将6.3g DNS和262.0 mL 2M NaOH溶液，加到500.0 mL含有185.0 g酒石酸钾钠的热水溶液中，依次加入苯酚 5.0g，偏重亚硫酸钠5.0g，搅拌全部溶解，定容至1000 ml。贮于棕色瓶中备用。
1.3.3.缓冲液的配置
（1）pH4.6 0.1M 柠檬酸缓冲液：称取 21.01g 一水柠檬酸C6H8O7.H2O 溶于水，定容至1000mL为A液，称取柠檬酸三钠Na3C6H5O7·2H2O29.4g溶于水定容至1000mL，为B液。分别量取A液445mL、B液555mL，即配置成为pH4.6、0.1M 柠檬酸缓冲液1000ml。
（2）pH4.6 0.2M乙酸缓冲液：准确称取27.23g 三水乙酸钠溶于蒸馏水，定容至1000mL称为A液，量筒量取11.7mL乙酸加蒸馏水定容至1000mL称为B液，分别量取A液490mL、B液510mL配成pH4.6、0.2M乙酸缓冲液1000mL。
（3）pH5.8 0.2M 乙酸缓冲液：称取27.23g三水乙酸钠溶于蒸馏水水中，定容至1000mL，称为A液，用量筒量取11.7mL乙酸加蒸馏水定容至1000mL称为B液，分别量取A液940mL、B液60mL配成pH5.8、0.2M乙酸缓冲液1000mL。
1.4.废弃菌糠浸提液中的木聚糖酶的提取
对8种菌糠来源伊春当地菌户种植品种（4株木耳、1株平菇、1株金针菇、1株元蘑、1株猴头菇）中所含酶的酶活进行测定，并进行木聚糖酶的粗提取。利用水浸提法提取几种菌糠中的木聚糖酶，称取干燥菌糠20g破碎后，按照液料比50：1，加蒸馏水在室温25℃下浸提12小时，过滤后，冷冻离心机4000rpm条件下离心5min，上清液即为粗酶液。
1.5菌糠中酶活性的测定
1.5.1木聚糖酶活力定義
1mL酶液在温度50℃，pH值5.0条件下，1min水解木聚糖生成1?mol木糖还原物质的量为1个酶活力单位，单位以IU/mL表示。
1.5.2CMC 酶活性的测定
参照 Mandels et al.的方法[3]，向试管（3 支样品，1 支对照）中加入 0.5%的 CMC-Na 溶液 0.75mL，样品管加粗酶液 0.25mL，50℃恒温水浴保温 30min后，立即取出加入0.75mL 配置好的DNS试剂，其中对照管中加完0.75dns溶液后，再加入0.25ml的酶液，然后进行沸水浴10min，取出后立即用凉水冷却，再加入10mL蒸馏水，充分摇匀，用紫外分光光度计于540nm条件下测 OD 值，并依据葡萄糖标准曲线（图 2）求得还原糖量。 1.5.3木聚糖酶活性测定
Shamala TR et al.的方法[4]向试管中（3支样品，1支对照）加入0.5%的木聚糖（XYLEN，用PH4.6、0.2M乙酸缓冲液配制）0.75mL，粗酶液 0.25mL，50℃恒温水浴保温30min后，立即取出加入0.75mL 配置好的DNS试剂，其中对照管中加完0.75dns溶液后，再加入0.25ml的酶液，然后进行沸水浴10min，取出后立即用凉水冷却，再加入10mL蒸馏水，充分摇匀，用紫外分光光度计于540nm条件下测 OD 值，依据木糖标准曲线（图1）求得还原糖量。
1.5.4淀粉酶活性测定
参照王玉万等[5]的方法，向试管（3支样品，1支对照）中加入0.5%的可溶性淀粉溶液 0.5mL，样品管加粗酶液 0.5mL，混匀，38℃恒温水浴保温30min后，立即取出加入0.75mL 配置好的DNS试剂，其中对照管中加完0.75dns溶液后，再加入0.5ml的酶液，然后进行沸水浴10min，取出后立即用凉水冷却，再加入10mL蒸馏水，充分摇匀，用紫外分光光度计于540nm条件下测 OD 值，依据葡萄糖标准曲线（见图2）求得还原糖量。
1.6利用废弃菌糠浸提液提取含木聚糖酶的粗酶制剂
菌糠25 ℃浸提（液固比为 50∶1）→搅拌后静置 10小时→过滤→ 去上清液留取沉淀→最佳饱和度硫酸铵沉淀→4000rpm 冷冻离心机离心→收集沉淀→冷冻干燥→含木聚糖的粗酶制剂
2.结果与分析
2.1标准曲线
由图1可知，采用DNS法检测木聚糖酶作用不同浓度木聚糖（图1-1），酶活力可用OD540nm数值反应，标准曲线的线性方程及相关系数（图1-2）以不同浓度木聚糖酶作用一定木聚糖，由图可知相关系数都大于0.9，可知，采用DNS法检测木聚糖受木聚糖酶作用情况是可行的，并且，实验发现，底物浓度一定，酶浓度高于一定值时DNS检测值不再变化。从图2可以看出，采用DNS法在OD540nm检测发现，在0～2.5 mg/mL范围内，标准曲线的线性回归方程为y=1.2068x+0.0218，相关系数R2=0.9989。相关系数大于0.9，表明其线性关系可充分满足仪器分析的要求。
2.2食用菌废弃菌糠含酶量的检测分析
按1.5方法对8种废弃菌糠中的纤维素酶，淀粉酶、木聚糖酶的酶活进行了检测，具体结果如图3。其中LK开头的菌种均为黑木耳品种。对其结果进行分析，（图3A）8种食用真菌菌糠中LK16产纤维素酶能力最强，酶活为122.13IU/g。平菇产纤维素能力最弱，酶活为20.7IU/g。（图3B）8种废弃菌糠中，猴头菇产淀粉酶能力最强，酶活为134.03IU/g。Lk916产淀粉酶能力最弱，酶活为9.68IU/g。（图3C）元蘑产木聚糖酶能力最强，酶活为406.98IU/g。黑木耳LK8产木聚糖酶能力次之，酶活为384.2IU/g。平菇产木聚糖酶能力最弱，酶活为192.05IU/g。
3讨论
食用菌做为主要的木腐性、草腐性真菌，其生长特点是利用木质和草质纤维作为主要碳源，通过分泌具有专性纤维素酶和木聚糖酶系，从而用来分解培养基质中的纤维素及半纤维素，使其能够得到再吸收利用；并且，木聚糖酶属胞外酶，具有可诱导性，基质中的特异性物质可诱导该酶的合成、增加该酶代谢量，此项目正是基于利用食用菌生长代谢特性与木聚糖酶的合成特点而设计的。
由于在食用菌栽培过中会分解培养基质从而代谢产生木聚糖酶系，在大量食用菌采摘结束后，废弃菌糠中仍会具有一定的木聚糖酶。所以，对食用菌生产过程中的废弃料——菌糠进行木聚糖酶含量研究，利用菌糠浸提木聚糖酶粗酶，具有来源丰富、成本低等优势，菌糠的再利用在增加产值的同时减少了废弃物排放量，治理了环境，具有更为深远的环境效益。
4.结论
对8种食用真菌废弃菌糠浸提液中所含纤维素酶、淀粉酶、木聚糖酶的三种酶活进行检测，结果为显示。LK16产纤维素酶能力最强，酶活为122.13IU/g。平菇产纤维素能力最弱，酶活为20.7IU/g。猴头菇产淀粉酶能力最强，酶活为134.03IU/g。Lk916产淀粉酶能力最弱，酶活为9.68IU/g。元蘑产木聚糖酶能力最强，酶活最高为406.98IU/g。LK8的菌糠产木聚糖酶能力仅次之，酶活为384.2IU/g。平菇产木聚糖酶能力最弱，酶活为192.05IU/g
参考文献：
[1]韩增华，张丕奇，孔祥辉，马庆芳，戴肖东，张介驰. 黑木耳胞外酶活变化与栽培性状比较的研究[J]. 食用菌学报，2007. 14（4）：41-46
[2]于俊杰，赫荣琳，武改红，张粲，陈树林，张同存. 复合木质纤维素酶菌株筛选及其培养条件优化[J]. 生物技术通报，2013.4：101-109
[3]张凤芹，不同糖类对鸡腿菇胞外酶活性及多糖分泌的影響，食用菌，1999，21（4）9
[4] Mandels M，Hontz L，Nystrom J et al. Enzymatic hydrolysis of waste cellulase[J]. Biotechnol Bioeng，1974，16：1471～ 1493.
[5]王玉万，王云，构菌栽培过程中对木质纤维素的降解和几种多糖分解酶的活性变化[J]. 微生物学通报，1989，16（3）：137～189.
通讯作者简介：
马珂 硕士，林业工程师 研究方向：食用菌遗传育种。
基金项目：
黑龙江省森林工业总局 项目编号 sgzjy2013015
关键词：木聚糖酶；食用真菌；废弃菌糠；浸提
木聚糖酶（xylanase）是一类能够损坏植物纤维组织，降解半纤维素，其主要成分为木聚糖的一组酶的总称，是具有可诱导性的。木聚糖酶已被广泛应用于工业生产，动物饲料饲喂，食品加工添加，能源开发，环境治理，造纸行业以及功能性低聚糖制备等领域，同时，还可为食用菌优质品种选育及分析归类提供重要参考[1]。木聚糖酶产生菌来源目前主要通过以下几个方法，自然菌株的筛选，或通过诱变、蛋白质工程、以及基因工程等分子技术改造产酶基因。目前国内主流研究主要集中在利用工程化菌株来生产木聚糖酶，其中青霉、木霉、黑曲霉、链霉菌、酵母菌[2]等研究比较多。利用废弃菌糠浸提液提取木聚糖酶进行研究，从8种大型食用真菌废弃菌糠中筛选产木聚糖酶能力较强的真菌种类，为木聚糖酶生产提供基础的研究数据和相关参考资料，为实际生产中产生的大量菌糠进行再利用，从而创造经济价值与环境价值提供参考。
黑龙江省伊春市以2010年为例，伊春黑木耳栽培量5.1亿袋，产销量巨大，年产菌糠50万吨，然而，这大量的菌糠并没有企业或工厂能够进行生产利用，主要的处理方式即简单的原地堆砌、焚烧或掩埋，造成了严重的空气、土壤、水源的污染，如果能够成功回收废弃的菌糠对其进行在利用，将可获得经济上及环境保护治理方面的双重重大意义。
1材料与方法
1.1实验材料
8种（4株木耳、1株平菇、1株金针菇、1株元蘑、1株猴头菇）食用真菌菌糠为实验对象。（菌糠来源伊春本地菌户养殖的食用菌品种的废弃菌袋）
1.2药品试剂与仪器设备
1、主要药品
木聚糖、木糖、羧甲基纤维素钠、可溶性淀粉、酒石酸钾钠、水杨酸、苯酚等多数药品购自上海生工生物公司，药品多为国产分析纯。
2、主要仪器设备
LS-B75L立式压力蒸汽灭菌器，TDL5M台式高速离心机，HH-BLL电热恒温培养箱，U3010可见紫外分光光计，
Zd-85气浴恒温振荡器，AL104电子天平，DELTA320 pH计，JHI-SS超净工作台。
1.3主要试剂的配置
1.31底物的配置
（1）0.5%CMC-Na 溶液：取 0.5gCMC-Na 定溶于 100mL 的 pH4.6、0.1M 柠檬酸缓冲液。
（2）0.5%木聚糖溶液：取0.5g木聚糖定溶于100mL pH4.6、0.2M 乙酸缓冲液。
（3）0.5%可溶性淀粉：取0.5g可溶性淀粉定溶于100mL pH5.8、0.2M 乙酸缓冲液。
1.3.2 3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂的配置
将6.3g DNS和262.0 mL 2M NaOH溶液，加到500.0 mL含有185.0 g酒石酸钾钠的热水溶液中，依次加入苯酚 5.0g，偏重亚硫酸钠5.0g，搅拌全部溶解，定容至1000 ml。贮于棕色瓶中备用。
1.3.3.缓冲液的配置
（1）pH4.6 0.1M 柠檬酸缓冲液：称取 21.01g 一水柠檬酸C6H8O7.H2O 溶于水，定容至1000mL为A液，称取柠檬酸三钠Na3C6H5O7·2H2O29.4g溶于水定容至1000mL，为B液。分别量取A液445mL、B液555mL，即配置成为pH4.6、0.1M 柠檬酸缓冲液1000ml。
（2）pH4.6 0.2M乙酸缓冲液：准确称取27.23g 三水乙酸钠溶于蒸馏水，定容至1000mL称为A液，量筒量取11.7mL乙酸加蒸馏水定容至1000mL称为B液，分别量取A液490mL、B液510mL配成pH4.6、0.2M乙酸缓冲液1000mL。
（3）pH5.8 0.2M 乙酸缓冲液：称取27.23g三水乙酸钠溶于蒸馏水水中，定容至1000mL，称为A液，用量筒量取11.7mL乙酸加蒸馏水定容至1000mL称为B液，分别量取A液940mL、B液60mL配成pH5.8、0.2M乙酸缓冲液1000mL。
1.4.废弃菌糠浸提液中的木聚糖酶的提取
对8种菌糠来源伊春当地菌户种植品种（4株木耳、1株平菇、1株金针菇、1株元蘑、1株猴头菇）中所含酶的酶活进行测定，并进行木聚糖酶的粗提取。利用水浸提法提取几种菌糠中的木聚糖酶，称取干燥菌糠20g破碎后，按照液料比50：1，加蒸馏水在室温25℃下浸提12小时，过滤后，冷冻离心机4000rpm条件下离心5min，上清液即为粗酶液。
1.5菌糠中酶活性的测定
1.5.1木聚糖酶活力定義
1mL酶液在温度50℃，pH值5.0条件下，1min水解木聚糖生成1?mol木糖还原物质的量为1个酶活力单位，单位以IU/mL表示。
1.5.2CMC 酶活性的测定
参照 Mandels et al.的方法[3]，向试管（3 支样品，1 支对照）中加入 0.5%的 CMC-Na 溶液 0.75mL，样品管加粗酶液 0.25mL，50℃恒温水浴保温 30min后，立即取出加入0.75mL 配置好的DNS试剂，其中对照管中加完0.75dns溶液后，再加入0.25ml的酶液，然后进行沸水浴10min，取出后立即用凉水冷却，再加入10mL蒸馏水，充分摇匀，用紫外分光光度计于540nm条件下测 OD 值，并依据葡萄糖标准曲线（图 2）求得还原糖量。 1.5.3木聚糖酶活性测定
Shamala TR et al.的方法[4]向试管中（3支样品，1支对照）加入0.5%的木聚糖（XYLEN，用PH4.6、0.2M乙酸缓冲液配制）0.75mL，粗酶液 0.25mL，50℃恒温水浴保温30min后，立即取出加入0.75mL 配置好的DNS试剂，其中对照管中加完0.75dns溶液后，再加入0.25ml的酶液，然后进行沸水浴10min，取出后立即用凉水冷却，再加入10mL蒸馏水，充分摇匀，用紫外分光光度计于540nm条件下测 OD 值，依据木糖标准曲线（图1）求得还原糖量。
1.5.4淀粉酶活性测定
参照王玉万等[5]的方法，向试管（3支样品，1支对照）中加入0.5%的可溶性淀粉溶液 0.5mL，样品管加粗酶液 0.5mL，混匀，38℃恒温水浴保温30min后，立即取出加入0.75mL 配置好的DNS试剂，其中对照管中加完0.75dns溶液后，再加入0.5ml的酶液，然后进行沸水浴10min，取出后立即用凉水冷却，再加入10mL蒸馏水，充分摇匀，用紫外分光光度计于540nm条件下测 OD 值，依据葡萄糖标准曲线（见图2）求得还原糖量。
1.6利用废弃菌糠浸提液提取含木聚糖酶的粗酶制剂
菌糠25 ℃浸提（液固比为 50∶1）→搅拌后静置 10小时→过滤→ 去上清液留取沉淀→最佳饱和度硫酸铵沉淀→4000rpm 冷冻离心机离心→收集沉淀→冷冻干燥→含木聚糖的粗酶制剂
2.结果与分析
2.1标准曲线
由图1可知，采用DNS法检测木聚糖酶作用不同浓度木聚糖（图1-1），酶活力可用OD540nm数值反应，标准曲线的线性方程及相关系数（图1-2）以不同浓度木聚糖酶作用一定木聚糖，由图可知相关系数都大于0.9，可知，采用DNS法检测木聚糖受木聚糖酶作用情况是可行的，并且，实验发现，底物浓度一定，酶浓度高于一定值时DNS检测值不再变化。从图2可以看出，采用DNS法在OD540nm检测发现，在0～2.5 mg/mL范围内，标准曲线的线性回归方程为y=1.2068x+0.0218，相关系数R2=0.9989。相关系数大于0.9，表明其线性关系可充分满足仪器分析的要求。
2.2食用菌废弃菌糠含酶量的检测分析
按1.5方法对8种废弃菌糠中的纤维素酶，淀粉酶、木聚糖酶的酶活进行了检测，具体结果如图3。其中LK开头的菌种均为黑木耳品种。对其结果进行分析，（图3A）8种食用真菌菌糠中LK16产纤维素酶能力最强，酶活为122.13IU/g。平菇产纤维素能力最弱，酶活为20.7IU/g。（图3B）8种废弃菌糠中，猴头菇产淀粉酶能力最强，酶活为134.03IU/g。Lk916产淀粉酶能力最弱，酶活为9.68IU/g。（图3C）元蘑产木聚糖酶能力最强，酶活为406.98IU/g。黑木耳LK8产木聚糖酶能力次之，酶活为384.2IU/g。平菇产木聚糖酶能力最弱，酶活为192.05IU/g。
3讨论
食用菌做为主要的木腐性、草腐性真菌，其生长特点是利用木质和草质纤维作为主要碳源，通过分泌具有专性纤维素酶和木聚糖酶系，从而用来分解培养基质中的纤维素及半纤维素，使其能够得到再吸收利用；并且，木聚糖酶属胞外酶，具有可诱导性，基质中的特异性物质可诱导该酶的合成、增加该酶代谢量，此项目正是基于利用食用菌生长代谢特性与木聚糖酶的合成特点而设计的。
由于在食用菌栽培过中会分解培养基质从而代谢产生木聚糖酶系，在大量食用菌采摘结束后，废弃菌糠中仍会具有一定的木聚糖酶。所以，对食用菌生产过程中的废弃料——菌糠进行木聚糖酶含量研究，利用菌糠浸提木聚糖酶粗酶，具有来源丰富、成本低等优势，菌糠的再利用在增加产值的同时减少了废弃物排放量，治理了环境，具有更为深远的环境效益。
4.结论
对8种食用真菌废弃菌糠浸提液中所含纤维素酶、淀粉酶、木聚糖酶的三种酶活进行检测，结果为显示。LK16产纤维素酶能力最强，酶活为122.13IU/g。平菇产纤维素能力最弱，酶活为20.7IU/g。猴头菇产淀粉酶能力最强，酶活为134.03IU/g。Lk916产淀粉酶能力最弱，酶活为9.68IU/g。元蘑产木聚糖酶能力最强，酶活最高为406.98IU/g。LK8的菌糠产木聚糖酶能力仅次之，酶活为384.2IU/g。平菇产木聚糖酶能力最弱，酶活为192.05IU/g
参考文献：
[1]韩增华，张丕奇，孔祥辉，马庆芳，戴肖东，张介驰. 黑木耳胞外酶活变化与栽培性状比较的研究[J]. 食用菌学报，2007. 14（4）：41-46
[2]于俊杰，赫荣琳，武改红，张粲，陈树林，张同存. 复合木质纤维素酶菌株筛选及其培养条件优化[J]. 生物技术通报，2013.4：101-109
[3]张凤芹，不同糖类对鸡腿菇胞外酶活性及多糖分泌的影響，食用菌，1999，21（4）9
[4] Mandels M，Hontz L，Nystrom J et al. Enzymatic hydrolysis of waste cellulase[J]. Biotechnol Bioeng，1974，16：1471～ 1493.
[5]王玉万，王云，构菌栽培过程中对木质纤维素的降解和几种多糖分解酶的活性变化[J]. 微生物学通报，1989，16（3）：137～189.
通讯作者简介：
马珂 硕士，林业工程师 研究方向：食用菌遗传育种。
基金项目：
黑龙江省森林工业总局 项目编号 sgzjy2013015