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摘 要 以‘石硖’龙眼果肉为材料，在（4±0.5）℃条件下贮藏，并将贮藏后期不同状态果肉分为自溶与未自溶2部分，对其中的乙醇脱氢酶（ADH）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、过氧化氢酶（CAT）、细胞色素氧化酶（COD）、苹果酸脱氢酶（MDH）、多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）、超氧物歧化酶（SOD）8个酶进行同工酶电泳检测，以果肉在贮藏过程中的变化为参照，对龙眼果肉自溶与同工酶变化的关系进行探讨。结果表明：“石硖”龙眼低温贮藏过程中，整果果肉除POD外其余7个酶同工酶酶谱变化不大；但贮藏后期自溶果肉与未自溶果肉酶谱差异显著，其中未自溶果肉与刚采收果肉（第0天）酶谱差异不大。说明即使在同一果实中，自溶与未自溶果肉生理状况明显不同，龙眼采后果肉的生理变化主要集中在自溶果肉部分，未自溶的果肉基本维持与刚采收时相近的生理状态。自溶与未自溶果肉中，APX、CAT、MDH、COD、PPD和POD酶谱条带数目、种类以及表达量间差异显著，这几种酶可能与龙眼果肉的自溶有密切关系。
关键词 龙眼（Dimocarpus longan Lonn.）；果肉自溶；同工酶；电泳
中图分类号 Q814 文献标识码 A
Abstract The isozyme of alcohol dehydrogenase（ADH）， ascorbate peroxidase（APX）， catalase（CAT）， cytochrome c oxidase（COD）， malate dehydrogenase（MDH）， polyphenol oxidase（PPO）， peroxidase（POD） and superoxide dismutase（SOD） in Longan（Dimocarpus longan Lour cv.‘Shixia’）pulp stored at 3-5 ℃ and divided into‘pulp-breakdown’and‘intact’at the end of storage were determined. The results showed that except the POD isozyme，the other 7 isozymes had a slightly changes in the band during storage of the pulp samples. But the bands of the breakdown pulp hada significant difference from those of the intact pulp which were similar to fresh pulp in 0 day. The results indicated that even in the same fruit pulp，there had a different physiology states between the breakdown pulp and the intact pulp. Postharvest physiology changes toke place mainly in the breakdown pulp of longan. The changes of amount，types and expression of APX， CAT， MDH， COD and POD isozymes’bands indicated that these enzymes maybe associate closely with pulp-breakdown process of longan pulp.
Key words Longan；Pulp-breakdown；Isozyme；Electrophoresis
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.031
采后龙眼鲜果难以保鲜，除了果皮的迅速褐变外，果肉的快速软化、流汁和腐烂更为突出，其特征是果壳外观看似完整，实际上内部果肉已经开始溶解、流汁，趋于腐败，这是龙眼果实在生命最后阶段表现出来的相似症状，一些研究者又称这种现象为“自溶”[1]。周云等[2]、梁汉华等[3]、韩冬梅等[4]、林河通等[5]分别对龙眼果肉自溶进行了研究，但主要是对龙眼果肉自溶现象进行描述，并提出了龙眼在贮藏中后期可能是先发生果肉的自溶后因微生物侵染而加速其腐败的观点，张强等[6]发现龙眼果肉衰老劣变与一些氧化还原酶及抗氧化能力的变化有密切关系。本研究探讨了一些与衰老相关的氧化还原酶同工酶在龙眼果肉自溶过程中的变化，特别是对比同一果实的自溶果肉与未自溶果肉中这些酶同工酶的差异，以期为进一步弄清龙眼果肉自溶机理提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
以广东省主栽优质龙眼品种“石硖”龙眼（Dimocarpus longan Lour.）果实为试验材料。“石硖”龙眼果实采自广东省农科院果树研究所龙眼园。采收成熟度为8～9成熟，上午采摘的龙眼当天运回，剪下单果后，挑选出大小均匀，无病虫害的果实用于试验，以0.3%含氯消毒剂清洗，晾干后，以0.02 mm厚的低密度聚乙烯袋（LDPE）包装，每袋50个果，贮藏在（4±0.5）℃的恒温箱（SANYO MIP-553）中。每7 d取样一次，其中最后一天（49 d）取样时，将果肉分成已自溶与未自溶2部分，以刀片对果肉进行随机切割取样。所取果肉样品，以液氮冻结彻底后用锡箔纸包好，放入自封袋中，存放于-40 ℃冰箱。
1.2 方法
1.2.1 电泳 电泳参考胡能书等[7]的方法，以不连续的聚丙烯酰胺凝胶活性电泳法（Native-PAGE）对可溶性蛋白进行分析。
1.2.2 乙醇脱氢酶（ADH）（E C 1.1.1.1） 粗酶制备参考李振国[8]的方法，略加修改，提取缓冲液为含5 mmol/L MgCl2和1 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）的PBS（0.1 mol/L、pH7.5）。染色参照胡能书等[7]的方法，染色液组成：96 mL Tris-HCl缓冲液（50 mmol/L、pH8.0）（其中含NAD 40 mg、NBT 30 mg、PMS 3 mg），用时加入4 mL 95%乙醇，室温避光染色，条带呈蓝紫色。 1.2.3 抗坏血酸过氧化物酶（APX）（E C 1.11.1.11） 粗酶制备参考沈文飚等[9]的方法，略作修改，提取缓冲液为含0.1 mmol/L EDTA-Na2、2 mmol/L AsA的K2HPO4-KH2PO4缓冲液（50 mmol/L、pH7.0）。染色参照Mittlet等[10]的方法。
1.2.4 过氧化氢酶（CAT）（E C 1.11.1.6） 粗酶制备参考Chance等[11]的方法，提取缓冲液为50 mmol/L、pH7.0的PBS。染色参考孙彩霞等[12]的方法略作修改分3步进行（1）将凝胶放在经过预冷的1%淀粉溶液（置于沸水浴中至无色透明）中于4 ℃浸泡90 min（2）浸泡于0.3% H2O2中，室温下静置1 min后以双蒸水漂洗（3）置于0.5%KI（每200 mL加入1 mL冰醋酸酸化）中浸泡染色。此法为负染，即酶带为蓝色背景中无色透明的条带。
1.2.5 细胞色素氧化酶（COD）（E C 1.9.3.1） 粗酶制备参照夏涛等[13]的方法，略作修改，提取缓冲液为含5 mmol/L EDTA-Na2的50 mmol/L、pH7.5的Tris-HCl。染色参照胡能书等[7]的方法，染色液体含1%二甲基对苯二胺、1%α-萘酚（溶于40%乙醇）和PBS（0.1 mol/L、pH7.4），三者以1 ∶ 1 ∶ 25（V ∶ V ∶ V）混合，室温避光染色，条带呈蓝紫色。
1.2.6 苹果酸脱氢酶（MDH）（E C 1.1.1.37） 粗酶制备参考欧阳光察[14]的方法，提取缓冲液为含10 mmol/L MgCl2和0.2 mmol/L EDTA的PBS（0.1 mol/L、pH7.5）。染色参考彭永康等[15]的方法，略作修改，染色液为100 mL PBS（0.1 mol/L、pH6.8），其中含NAD 30 mg、NBT 30 mg、PMS 3 mg、DL-苹果酸250 mg，室温避光染色，条带呈蓝紫色。
1.2.7 过氧化物酶（POD）（E C 1.11.1.7） 粗酶制备参照曾韶西等[16]的方法，略作修改，提取缓冲液为0.15 mol/L、pH7.0的PBS。染色参照沈德绪[17]的改良醋酸联苯胺法。按次序将1份2%醋酸-联苯胺（1 g联苯胺溶于9 mL热的冰醋酸，再以水定容到50 mL）、1份4%NH4Cl 、1份5% EDTA、1份0.3% H2O2和8份双蒸水混合成染色液，室温下浸泡染色，条带呈天蓝色。
1.2.8 多酚氧化酶（PPO）（E C 1.10.3.1） 粗酶制备参照谭兴杰等[18]的方法，略作修改，提取缓冲液为50 mmol/L、pH7.0的PBS。染色参照薛俊杰等[19]的方法，将10 mmol/L邻苯二酚、0.01 %对苯二胺与PBS（50 mmol/L、pH6.8）以3 ∶ 1 ∶ 1（V ∶ V ∶ V）混合后，室温下浸泡染色，条带呈红棕色。
1.2.9 超氧化物歧化酶（SOD）（E C 1.15.1.1） 粗酶制备参考邵从本等[20]的方法，染色参照李中振等[21]的方法。
2 结果与分析
2.1 龙眼果肉贮藏及自溶过程中ADH同工酶的变化
贮藏过程中各时间段样品间以及与完整果肉的ADH同工酶间差异不大，而自溶果肉ADH条带则明显减弱（图1）。3条同工酶谱带中，以中间谱带较稳定，第1条谱带变化较大。
2.2 龙眼果肉贮藏及自溶过程中APX、CAT、COD、MDH、PPO同工酶的变化
APX（图2）、 CAT（图3）、 COD（图4）、 MDH（图5）、 PPO（图6）5种酶同工酶在不同贮藏期样品间及其与完整果肉相比，其图谱差异均不大，但自溶果肉的图谱则与未自溶果肉样品差异显著，特别是APX、CAT和COD同工酶。说明这些酶在龙眼果肉发生自溶的时候，其合成代谢及酶结构可能发生了明显的变化。
2.3 龙眼果肉贮藏及自溶过程中POD同工酶的变化
POD同工酶在贮藏中，其条带数量及表达强弱都发生变化，自溶果肉与未自溶果肉的POD同工酶图谱差异显著（图7），说明POD同工酶在龙眼低温贮藏过程中一直变化，并且在果肉自溶中发挥作用。
2.4 龙眼果肉贮藏及自溶过程中SOD同工酶的变化
龙眼果肉中SOD同工酶较稳定，所有样品均只分离出3条酶带，贮藏时间及是否自溶对酶带的数量和强弱影响不大（图8）。
3 讨论与结论
龙眼果肉自溶是龙眼采后难以长期贮藏的一个重要原因[4]，果肉的自溶导致果实丧失食用价值和商品价值。已有研究发现荔枝和龙眼果皮褐变与PPO和POD同工酶的变化有密切关系[22-24]，而对于果肉品质劣变中这些酶同工酶的变化报道很少。本研究发现在龙眼果肉发生自溶后，APX、CAT、COD、MDH、PPO和POD酶同工酶也发生了较明显的变化，表现在其酶带数量和强弱的变化上，说明它们与自溶的发生、发展有较密切的关系，但这些酶同工酶是导致果肉自溶的原因还是果肉自溶所引起的结果，还需作进一步的研究。除POD外，贮藏过程中和贮藏后期未自溶果肉中的其余7种酶同工酶的酶谱与0 d的酶谱相似，在条带数量与染色深浅上都没有发生明显变化，说明低温冷藏过程中，如果未发生果肉自溶，这些酶的性质比较稳定。在8种酶同工酶中，贮藏时间及果肉自溶与否对SOD同工酶均无明显的影响，说明龙眼果肉中SOD是一个较稳定的酶，这与张强等[6]发现龙眼贮藏过程中果肉SOD活性变化很小的结果一致。Duan等[25]发现活性氧，特别是羟自由基的积累将促进细胞壁多糖的降解，导致龙眼果肉的自溶。本研究结果表明当果肉开始发生自溶时，CAT等氧化还原酶的同工酶变化可能使组织中活性氧代谢和能量代谢出现异常，导致活性氧的积累，从而促使果肉组织的降解与崩溃，也即出现自溶现象。 综合各同工酶电泳的结果可见，在龙眼自溶过程中，即使同一个果实里，自溶果肉与未自溶果肉的生理变化、代谢途径都有很大差异，因此在进行龙眼果肉自溶研究时，以整果果肉作为自溶进程的生理分析并不能真实地代表自溶本身的变化，若将果肉的不同状态分开进行研究，更有利于揭示龙眼果肉自溶的生理机理。
参考文献
[1] 施 清. 龙眼采后生理特性及保鲜技术研究[J]. 福建果树， 1990（2）： 1-4.
[2] 周 云， 季作梁， 林伟振. 龙眼冷藏适温及其冷害的研究[J]. 园艺学报， 1997， 24（1）： 13-18.
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关键词 龙眼（Dimocarpus longan Lonn.）；果肉自溶；同工酶；电泳
中图分类号 Q814 文献标识码 A
Abstract The isozyme of alcohol dehydrogenase（ADH）， ascorbate peroxidase（APX）， catalase（CAT）， cytochrome c oxidase（COD）， malate dehydrogenase（MDH）， polyphenol oxidase（PPO）， peroxidase（POD） and superoxide dismutase（SOD） in Longan（Dimocarpus longan Lour cv.‘Shixia’）pulp stored at 3-5 ℃ and divided into‘pulp-breakdown’and‘intact’at the end of storage were determined. The results showed that except the POD isozyme，the other 7 isozymes had a slightly changes in the band during storage of the pulp samples. But the bands of the breakdown pulp hada significant difference from those of the intact pulp which were similar to fresh pulp in 0 day. The results indicated that even in the same fruit pulp，there had a different physiology states between the breakdown pulp and the intact pulp. Postharvest physiology changes toke place mainly in the breakdown pulp of longan. The changes of amount，types and expression of APX， CAT， MDH， COD and POD isozymes’bands indicated that these enzymes maybe associate closely with pulp-breakdown process of longan pulp.
Key words Longan；Pulp-breakdown；Isozyme；Electrophoresis
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.031
采后龙眼鲜果难以保鲜，除了果皮的迅速褐变外，果肉的快速软化、流汁和腐烂更为突出，其特征是果壳外观看似完整，实际上内部果肉已经开始溶解、流汁，趋于腐败，这是龙眼果实在生命最后阶段表现出来的相似症状，一些研究者又称这种现象为“自溶”[1]。周云等[2]、梁汉华等[3]、韩冬梅等[4]、林河通等[5]分别对龙眼果肉自溶进行了研究，但主要是对龙眼果肉自溶现象进行描述，并提出了龙眼在贮藏中后期可能是先发生果肉的自溶后因微生物侵染而加速其腐败的观点，张强等[6]发现龙眼果肉衰老劣变与一些氧化还原酶及抗氧化能力的变化有密切关系。本研究探讨了一些与衰老相关的氧化还原酶同工酶在龙眼果肉自溶过程中的变化，特别是对比同一果实的自溶果肉与未自溶果肉中这些酶同工酶的差异，以期为进一步弄清龙眼果肉自溶机理提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
以广东省主栽优质龙眼品种“石硖”龙眼（Dimocarpus longan Lour.）果实为试验材料。“石硖”龙眼果实采自广东省农科院果树研究所龙眼园。采收成熟度为8～9成熟，上午采摘的龙眼当天运回，剪下单果后，挑选出大小均匀，无病虫害的果实用于试验，以0.3%含氯消毒剂清洗，晾干后，以0.02 mm厚的低密度聚乙烯袋（LDPE）包装，每袋50个果，贮藏在（4±0.5）℃的恒温箱（SANYO MIP-553）中。每7 d取样一次，其中最后一天（49 d）取样时，将果肉分成已自溶与未自溶2部分，以刀片对果肉进行随机切割取样。所取果肉样品，以液氮冻结彻底后用锡箔纸包好，放入自封袋中，存放于-40 ℃冰箱。
1.2 方法
1.2.1 电泳 电泳参考胡能书等[7]的方法，以不连续的聚丙烯酰胺凝胶活性电泳法（Native-PAGE）对可溶性蛋白进行分析。
1.2.2 乙醇脱氢酶（ADH）（E C 1.1.1.1） 粗酶制备参考李振国[8]的方法，略加修改，提取缓冲液为含5 mmol/L MgCl2和1 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）的PBS（0.1 mol/L、pH7.5）。染色参照胡能书等[7]的方法，染色液组成：96 mL Tris-HCl缓冲液（50 mmol/L、pH8.0）（其中含NAD 40 mg、NBT 30 mg、PMS 3 mg），用时加入4 mL 95%乙醇，室温避光染色，条带呈蓝紫色。 1.2.3 抗坏血酸过氧化物酶（APX）（E C 1.11.1.11） 粗酶制备参考沈文飚等[9]的方法，略作修改，提取缓冲液为含0.1 mmol/L EDTA-Na2、2 mmol/L AsA的K2HPO4-KH2PO4缓冲液（50 mmol/L、pH7.0）。染色参照Mittlet等[10]的方法。
1.2.4 过氧化氢酶（CAT）（E C 1.11.1.6） 粗酶制备参考Chance等[11]的方法，提取缓冲液为50 mmol/L、pH7.0的PBS。染色参考孙彩霞等[12]的方法略作修改分3步进行（1）将凝胶放在经过预冷的1%淀粉溶液（置于沸水浴中至无色透明）中于4 ℃浸泡90 min（2）浸泡于0.3% H2O2中，室温下静置1 min后以双蒸水漂洗（3）置于0.5%KI（每200 mL加入1 mL冰醋酸酸化）中浸泡染色。此法为负染，即酶带为蓝色背景中无色透明的条带。
1.2.5 细胞色素氧化酶（COD）（E C 1.9.3.1） 粗酶制备参照夏涛等[13]的方法，略作修改，提取缓冲液为含5 mmol/L EDTA-Na2的50 mmol/L、pH7.5的Tris-HCl。染色参照胡能书等[7]的方法，染色液体含1%二甲基对苯二胺、1%α-萘酚（溶于40%乙醇）和PBS（0.1 mol/L、pH7.4），三者以1 ∶ 1 ∶ 25（V ∶ V ∶ V）混合，室温避光染色，条带呈蓝紫色。
1.2.6 苹果酸脱氢酶（MDH）（E C 1.1.1.37） 粗酶制备参考欧阳光察[14]的方法，提取缓冲液为含10 mmol/L MgCl2和0.2 mmol/L EDTA的PBS（0.1 mol/L、pH7.5）。染色参考彭永康等[15]的方法，略作修改，染色液为100 mL PBS（0.1 mol/L、pH6.8），其中含NAD 30 mg、NBT 30 mg、PMS 3 mg、DL-苹果酸250 mg，室温避光染色，条带呈蓝紫色。
1.2.7 过氧化物酶（POD）（E C 1.11.1.7） 粗酶制备参照曾韶西等[16]的方法，略作修改，提取缓冲液为0.15 mol/L、pH7.0的PBS。染色参照沈德绪[17]的改良醋酸联苯胺法。按次序将1份2%醋酸-联苯胺（1 g联苯胺溶于9 mL热的冰醋酸，再以水定容到50 mL）、1份4%NH4Cl 、1份5% EDTA、1份0.3% H2O2和8份双蒸水混合成染色液，室温下浸泡染色，条带呈天蓝色。
1.2.8 多酚氧化酶（PPO）（E C 1.10.3.1） 粗酶制备参照谭兴杰等[18]的方法，略作修改，提取缓冲液为50 mmol/L、pH7.0的PBS。染色参照薛俊杰等[19]的方法，将10 mmol/L邻苯二酚、0.01 %对苯二胺与PBS（50 mmol/L、pH6.8）以3 ∶ 1 ∶ 1（V ∶ V ∶ V）混合后，室温下浸泡染色，条带呈红棕色。
1.2.9 超氧化物歧化酶（SOD）（E C 1.15.1.1） 粗酶制备参考邵从本等[20]的方法，染色参照李中振等[21]的方法。
2 结果与分析
2.1 龙眼果肉贮藏及自溶过程中ADH同工酶的变化
贮藏过程中各时间段样品间以及与完整果肉的ADH同工酶间差异不大，而自溶果肉ADH条带则明显减弱（图1）。3条同工酶谱带中，以中间谱带较稳定，第1条谱带变化较大。
2.2 龙眼果肉贮藏及自溶过程中APX、CAT、COD、MDH、PPO同工酶的变化
APX（图2）、 CAT（图3）、 COD（图4）、 MDH（图5）、 PPO（图6）5种酶同工酶在不同贮藏期样品间及其与完整果肉相比，其图谱差异均不大，但自溶果肉的图谱则与未自溶果肉样品差异显著，特别是APX、CAT和COD同工酶。说明这些酶在龙眼果肉发生自溶的时候，其合成代谢及酶结构可能发生了明显的变化。
2.3 龙眼果肉贮藏及自溶过程中POD同工酶的变化
POD同工酶在贮藏中，其条带数量及表达强弱都发生变化，自溶果肉与未自溶果肉的POD同工酶图谱差异显著（图7），说明POD同工酶在龙眼低温贮藏过程中一直变化，并且在果肉自溶中发挥作用。
2.4 龙眼果肉贮藏及自溶过程中SOD同工酶的变化
龙眼果肉中SOD同工酶较稳定，所有样品均只分离出3条酶带，贮藏时间及是否自溶对酶带的数量和强弱影响不大（图8）。
3 讨论与结论
龙眼果肉自溶是龙眼采后难以长期贮藏的一个重要原因[4]，果肉的自溶导致果实丧失食用价值和商品价值。已有研究发现荔枝和龙眼果皮褐变与PPO和POD同工酶的变化有密切关系[22-24]，而对于果肉品质劣变中这些酶同工酶的变化报道很少。本研究发现在龙眼果肉发生自溶后，APX、CAT、COD、MDH、PPO和POD酶同工酶也发生了较明显的变化，表现在其酶带数量和强弱的变化上，说明它们与自溶的发生、发展有较密切的关系，但这些酶同工酶是导致果肉自溶的原因还是果肉自溶所引起的结果，还需作进一步的研究。除POD外，贮藏过程中和贮藏后期未自溶果肉中的其余7种酶同工酶的酶谱与0 d的酶谱相似，在条带数量与染色深浅上都没有发生明显变化，说明低温冷藏过程中，如果未发生果肉自溶，这些酶的性质比较稳定。在8种酶同工酶中，贮藏时间及果肉自溶与否对SOD同工酶均无明显的影响，说明龙眼果肉中SOD是一个较稳定的酶，这与张强等[6]发现龙眼贮藏过程中果肉SOD活性变化很小的结果一致。Duan等[25]发现活性氧，特别是羟自由基的积累将促进细胞壁多糖的降解，导致龙眼果肉的自溶。本研究结果表明当果肉开始发生自溶时，CAT等氧化还原酶的同工酶变化可能使组织中活性氧代谢和能量代谢出现异常，导致活性氧的积累，从而促使果肉组织的降解与崩溃，也即出现自溶现象。 综合各同工酶电泳的结果可见，在龙眼自溶过程中，即使同一个果实里，自溶果肉与未自溶果肉的生理变化、代谢途径都有很大差异，因此在进行龙眼果肉自溶研究时，以整果果肉作为自溶进程的生理分析并不能真实地代表自溶本身的变化，若将果肉的不同状态分开进行研究，更有利于揭示龙眼果肉自溶的生理机理。
参考文献
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