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【中图分类号】R512.63【文献标识码】A【文章编号】1632-5281（2015）4
摘要：目的 通过两种检测方法的比较，证实磁珠法无论在操作简便还是在灵敏度上是否优于柱提取法。方法 同一批标本同时进行磁珠法和柱提取法的检测，然后将检测结果按扩增曲线的循环数多少进行比较。结果 实验证实，磁珠法简便快捷，扩增曲线比柱提取法提前抬升3.652个循环；由于没有与磁珠法配套的扩增试剂，使用磁珠法提取，然后用柱提取法全套试剂扩增，无疑增加了检验成本。讨论：为了快出结果，提高检测灵敏度，建议使用磁珠法替代柱提取法进行核酸提取，同时尽快开发与磁珠法配套的核酸扩增试剂盒。
关键词： 磁珠法 柱提取法 循环数
磁珠法是最近几年在临床开展的一种快速提取核酸的新方法，与传统经典的柱提取法相比，操作简单，自动化程度高。我们对232例丙肝患者血液標本分别用磁珠法和柱提取法进行核酸提取，最后使用柱提取法扩增试剂按其提供的扩增程序说明书进行扩增。然后对两种方法的检测结果进行了比较。
1、材料与方法
1.1材料
1.1.1 标本来源
2014年5～7月本院住院及门诊送检丙肝基因检测血标本232例。及时分离血清，-20℃冷冻保存。
1.1.2 试剂与仪器
PCR扩增试剂（柱提取法）由上海科华生物科技有限公司提供。SLAN实时荧光基因扩增仪由上海宏石公司生产。H1650型高速离心机由湖南湘仪离心机厂生产。由西安天隆科技有限公司生产的NP968型核酸提取仪及其配套核酸提取试剂盒。严格按试剂操作说明书进行检测。
1.2 检测
将232例冷冻血清取出，室温融化、混匀。每一份标本分别取200ul血清按柱提取法和磁珠法说明书同时进行处理。
1.3方法
1.3.1磁珠法
于0.5ml离心管中分别加入20ul去抑制剂、100ul裂解液、100ul标准血清，震荡混匀，70℃加热10min，离心数秒，再加入无水乙醇110ul，振荡混匀，12000转/15分。小心吸取上清液，移入新的离心管中向上清中加入30ul的磁珠R（用之前充分混匀）和等体积的70%的乙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15～30℃下静置5分钟。用磁铁架收集磁珠，去除残液。 加入1ml的RPB（乙醇稀释过的）溶液重悬磁珠，室温放置1分钟。用磁铁架收集磁珠，去除残液。 室温晾干5分钟，充分去除酒精残留。加入100-200ul 的洗脱液，移液器充分吸打40次重悬磁珠。室温放置5分钟，期间充分震荡混匀一次。 用磁铁架收集磁珠。 将包含RNA的溶液转移至新的干净的试管中。
1.3.2 柱提取法
于0.5ml离心管中分别加入20ul去抑制剂、100ul裂解液、100ul标准血清，震荡混匀，70℃加热10min，离心数秒，再加入无水乙醇110ul，振荡混匀，转移到核酸提取柱中。将核酸提取柱放入2ml离心管中N转/分离心1min，；再向提取柱中加入500ul洗涤液A，N转/分离心1min；再加入洗涤液B， N转/分离心1min。（N转分别为3000、5000、8000、10000、12000转）
将核酸提取柱放入2ml新离心管中，14000转离心1min。将核酸提取柱再放入新的2ml离心管中加入50uL洗脱液，静置1min，10000转离心1min，取2ml离心管中液体上机扩增。
将两种方法提取的核酸上清液，按柱提取法扩增程序进行扩增。检测结果以柱提取法结果< 5.0*102IU /ml、5.0*102 ～9.9*103 IU /ml、1.0*104 ～9.9*104 IU /ml、1.0*105 ～9.9*105 IU /ml、1.0*106 ～9.9*106 IU /ml、>1.0*107 IU /ml分六组按循环数cycle多少进行比较。
2 结果
从两种方法不同浓度标本扩增曲线抬升的循环数大小可以看出，磁珠法的扩增曲线比柱提取法提前抬升的平均循环数为3.652，折合IU /ml大约101次方，但在不同数量级浓度上有差别。低浓度标本（5.0*102～9.9*103 IU /ml组 以及<5.0*102 IU /ml组）扩增效率提高不明显，尤其在<5.0*102 IU /ml组，出现了部分标本磁珠法的循环数甚至高于柱提取法的现象。在中、高浓度组，磁珠法比柱提取法提升循环数都在3个循环以上，没有出现磁珠法循环数高于柱提取法的问题。如表：
3 讨论
从随机标本不同浓度的检出例数可以看出，HCV-RNA<5.0*102 IU /ml组占所有标本的30%，其中扩增曲线抬头的阴性标本较多。可见，只要提高了检测灵敏度，就可以发现假阴性标本，有力的支持临床对丙型肝炎的诊断。已经在临床上发现了低病毒载量复制的丙型肝炎患者。已有文献证实磁珠法能提高检测灵敏度，我们从试验中也证实了这一点[1] [2]。只是<5.0*102 IU /ml的标本会出现检测结果不稳定的现象，甚至会出现磁珠法循环数高于柱提取法的现象，具体原因还有待进一步研究。
对中、高浓度组所有标本的循环数都比柱提取法减少3个循环以上，大约提高浓度101IU /ml。因此，建议在丙肝基因检测报告单上要标明提取和检测方法。因为不同的检测方法，其检测结果有差异。尤其对抗病毒治疗的患者一定要用同一种检测方法进行动态观测，否则会引起对结果变化的错误判断[3] [4]。
目前，磁珠法核酸提取都是在废弃原有柱提取法提取试剂的基础上，改用磁珠法提取试剂+柱提取法扩增试剂来进行检测的，无疑增加了检测成本。建议试剂生产厂家能够生产磁珠法专用的核酸提取、扩增试剂盒，以方便临床需要。
总之，磁珠法操作简便，自动化程度高，能有效避免因人为疏忽造成的结果错误，值得在临床推广。对于低浓度标本检出率提高不大的问题，建议磁珠法核酸提取试剂最好与高灵敏度核酸扩增试剂配套使用，才可以达到对低浓度标本检出率提高的目的，以方便临床确诊和治疗[3]。
4、参考文献
[1] 陆佳飞，周科隆，王缦.磁珠法快速提取乙型肝炎病毒DNA方法的建立及其应用研究.中华检验医学杂志[J].2012.35（9）843～850.
[2] 王洁，常静霞，张怡青等.两种国产乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂的检测效能评价.实用肝脏病杂志[J].2014.17（4）368～371.
[3] 舒孟军，盛蓉生，高峰.磁珠法测量痕量肝炎病毒的研究.检验医学与临床[J].2013.10（6）677～679.
[4]李德成，黄晓佳，陈雄毅.不同核酸提取方法在HBV-DNA荧光定量检测中的比较.国际检验医学杂志[J].2010.31（12）1361～1363.
作者：刘学敏，1980年，女，检验本科，主管检验师，长期从事基因检测工作 。
摘要：目的 通过两种检测方法的比较，证实磁珠法无论在操作简便还是在灵敏度上是否优于柱提取法。方法 同一批标本同时进行磁珠法和柱提取法的检测，然后将检测结果按扩增曲线的循环数多少进行比较。结果 实验证实，磁珠法简便快捷，扩增曲线比柱提取法提前抬升3.652个循环；由于没有与磁珠法配套的扩增试剂，使用磁珠法提取，然后用柱提取法全套试剂扩增，无疑增加了检验成本。讨论：为了快出结果，提高检测灵敏度，建议使用磁珠法替代柱提取法进行核酸提取，同时尽快开发与磁珠法配套的核酸扩增试剂盒。
关键词： 磁珠法 柱提取法 循环数
磁珠法是最近几年在临床开展的一种快速提取核酸的新方法，与传统经典的柱提取法相比，操作简单，自动化程度高。我们对232例丙肝患者血液標本分别用磁珠法和柱提取法进行核酸提取，最后使用柱提取法扩增试剂按其提供的扩增程序说明书进行扩增。然后对两种方法的检测结果进行了比较。
1、材料与方法
1.1材料
1.1.1 标本来源
2014年5～7月本院住院及门诊送检丙肝基因检测血标本232例。及时分离血清，-20℃冷冻保存。
1.1.2 试剂与仪器
PCR扩增试剂（柱提取法）由上海科华生物科技有限公司提供。SLAN实时荧光基因扩增仪由上海宏石公司生产。H1650型高速离心机由湖南湘仪离心机厂生产。由西安天隆科技有限公司生产的NP968型核酸提取仪及其配套核酸提取试剂盒。严格按试剂操作说明书进行检测。
1.2 检测
将232例冷冻血清取出，室温融化、混匀。每一份标本分别取200ul血清按柱提取法和磁珠法说明书同时进行处理。
1.3方法
1.3.1磁珠法
于0.5ml离心管中分别加入20ul去抑制剂、100ul裂解液、100ul标准血清，震荡混匀，70℃加热10min，离心数秒，再加入无水乙醇110ul，振荡混匀，12000转/15分。小心吸取上清液，移入新的离心管中向上清中加入30ul的磁珠R（用之前充分混匀）和等体积的70%的乙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15～30℃下静置5分钟。用磁铁架收集磁珠，去除残液。 加入1ml的RPB（乙醇稀释过的）溶液重悬磁珠，室温放置1分钟。用磁铁架收集磁珠，去除残液。 室温晾干5分钟，充分去除酒精残留。加入100-200ul 的洗脱液，移液器充分吸打40次重悬磁珠。室温放置5分钟，期间充分震荡混匀一次。 用磁铁架收集磁珠。 将包含RNA的溶液转移至新的干净的试管中。
1.3.2 柱提取法
于0.5ml离心管中分别加入20ul去抑制剂、100ul裂解液、100ul标准血清，震荡混匀，70℃加热10min，离心数秒，再加入无水乙醇110ul，振荡混匀，转移到核酸提取柱中。将核酸提取柱放入2ml离心管中N转/分离心1min，；再向提取柱中加入500ul洗涤液A，N转/分离心1min；再加入洗涤液B， N转/分离心1min。（N转分别为3000、5000、8000、10000、12000转）
将核酸提取柱放入2ml新离心管中，14000转离心1min。将核酸提取柱再放入新的2ml离心管中加入50uL洗脱液，静置1min，10000转离心1min，取2ml离心管中液体上机扩增。
将两种方法提取的核酸上清液，按柱提取法扩增程序进行扩增。检测结果以柱提取法结果< 5.0*102IU /ml、5.0*102 ～9.9*103 IU /ml、1.0*104 ～9.9*104 IU /ml、1.0*105 ～9.9*105 IU /ml、1.0*106 ～9.9*106 IU /ml、>1.0*107 IU /ml分六组按循环数cycle多少进行比较。
2 结果
从两种方法不同浓度标本扩增曲线抬升的循环数大小可以看出，磁珠法的扩增曲线比柱提取法提前抬升的平均循环数为3.652，折合IU /ml大约101次方，但在不同数量级浓度上有差别。低浓度标本（5.0*102～9.9*103 IU /ml组 以及<5.0*102 IU /ml组）扩增效率提高不明显，尤其在<5.0*102 IU /ml组，出现了部分标本磁珠法的循环数甚至高于柱提取法的现象。在中、高浓度组，磁珠法比柱提取法提升循环数都在3个循环以上，没有出现磁珠法循环数高于柱提取法的问题。如表：
3 讨论
从随机标本不同浓度的检出例数可以看出，HCV-RNA<5.0*102 IU /ml组占所有标本的30%，其中扩增曲线抬头的阴性标本较多。可见，只要提高了检测灵敏度，就可以发现假阴性标本，有力的支持临床对丙型肝炎的诊断。已经在临床上发现了低病毒载量复制的丙型肝炎患者。已有文献证实磁珠法能提高检测灵敏度，我们从试验中也证实了这一点[1] [2]。只是<5.0*102 IU /ml的标本会出现检测结果不稳定的现象，甚至会出现磁珠法循环数高于柱提取法的现象，具体原因还有待进一步研究。
对中、高浓度组所有标本的循环数都比柱提取法减少3个循环以上，大约提高浓度101IU /ml。因此，建议在丙肝基因检测报告单上要标明提取和检测方法。因为不同的检测方法，其检测结果有差异。尤其对抗病毒治疗的患者一定要用同一种检测方法进行动态观测，否则会引起对结果变化的错误判断[3] [4]。
目前，磁珠法核酸提取都是在废弃原有柱提取法提取试剂的基础上，改用磁珠法提取试剂+柱提取法扩增试剂来进行检测的，无疑增加了检测成本。建议试剂生产厂家能够生产磁珠法专用的核酸提取、扩增试剂盒，以方便临床需要。
总之，磁珠法操作简便，自动化程度高，能有效避免因人为疏忽造成的结果错误，值得在临床推广。对于低浓度标本检出率提高不大的问题，建议磁珠法核酸提取试剂最好与高灵敏度核酸扩增试剂配套使用，才可以达到对低浓度标本检出率提高的目的，以方便临床确诊和治疗[3]。
4、参考文献
[1] 陆佳飞，周科隆，王缦.磁珠法快速提取乙型肝炎病毒DNA方法的建立及其应用研究.中华检验医学杂志[J].2012.35（9）843～850.
[2] 王洁，常静霞，张怡青等.两种国产乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂的检测效能评价.实用肝脏病杂志[J].2014.17（4）368～371.
[3] 舒孟军，盛蓉生，高峰.磁珠法测量痕量肝炎病毒的研究.检验医学与临床[J].2013.10（6）677～679.
[4]李德成，黄晓佳，陈雄毅.不同核酸提取方法在HBV-DNA荧光定量检测中的比较.国际检验医学杂志[J].2010.31（12）1361～1363.
作者：刘学敏，1980年，女，检验本科，主管检验师，长期从事基因检测工作 。