论文部分内容阅读
摘要：以河南省民权县花园镇棉花枯萎病病株为材料，采用连续稀释法和单孢分离法得到枯萎菌单孢菌株，对该菌株进行形态学和显微形态学分析。采用真菌通用引物对所分离的菌株rDNA内转录间隔区（ITS）PCR扩增得到 544 bp 大小的片段（GenBank登录号为FJ715505），BLASTn分析结果显示，该序列与其他枯萎菌的ITS序列具有很高的同源性，将该ITS序列与GenBank中搜索到的同源性序列构建系统进化树，确定商丘地区棉花枯萎菌为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum），对该分离棉花枯萎菌菌株进一步进行致病力生物学鉴定。
关键词：棉花枯萎菌；单孢分离；ITS序列；致病力；分子鉴定；生物学鉴定；病害防治
中图分类号： S4356212 4文献标志码：
文章编号：1002-1302（2017）16-0086-03
收稿日期：2016-08-04
基金项目：国家自然科学基金（编号：31571997）；河南省高等学校重点科研项目（编号：16A210036）。
作者简介：娄喜艳（1984—），女，河南商丘人，硕士，讲师，从事植物生理学教学与研究。E-mail：lounan2005@163com。
棉花枯萎菌學名尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum），属半知菌亚门镰刀菌属，它是棉花上的重要病害，过去曾作为国内重要植物检疫对象，至今在有些省（市、区）仍作为植物检疫对象。枯萎菌引起的枯萎病在棉花苗期和现蕾期前后常引起大量死苗，残存的病株结铃明显减少，铃质量减轻直接影响棉花生产和棉农收入。此病最早于1892年在美国发现，以后随棉种调运而迅速扩散蔓延，目前在世界各主要产棉国均有发生。我国于1934年在江苏南通和上海川沙等县（市）最早发现此病，20世纪七八十年代初期，遍布全国各主要产棉区，并形成严重危害。20世纪80年代中期以后，随大量抗病品种的推广，枯萎病在我国南北棉区基本得到控制，但局部棉区发生仍然较重，其中特别是新疆棉区常造成大片死亡，目前仍是棉花生产上的一个重要问题。本试验采集河南省商丘地区棉花枯萎病病株，分离棉花枯萎菌单孢菌株，进行菌落形态学和显微形态学分析，并采用分子生物学的方法对该菌株核糖体DNA ITS序列进行鉴定，为进一步的棉花枯萎病的鉴定及防治提供科学的理论依据。
1材料与方法
11材料
河南省民权县采集的棉花枯萎病病株。棉花感病品种为冀棉11，由中国农业科学院棉花研究所提供。
12方法
121棉花枯萎菌的分离和纯化
制备PDA培养基，倒平板；棉花病枝经自来水冲洗，将棉花茎剥皮，在超净工作台上，将其切成长度为10～15 cm的圆柱体，用75%乙醇消毒 30 s 左右，无菌水冲洗，然后用01%氯化汞进行灭菌1 min，用无菌水冲洗2～3次；圆柱体切成4个切片或小薄片，每块组织均应为病健相间变色的维管束组织；放入培养基平板上，轻轻按压，每皿4块，排放均匀；28 ℃恒温箱中培养7～8 d。采用连续稀释法[3]和单孢分离法[4]，纯化分离菌株。
122棉花枯萎病菌形态学鉴定
肉眼观察棉花枯萎菌菌株的菌落形态、生长状况；制备水装片，显微观察棉花枯萎菌菌丝、分生孢子、分生孢子梗等特征。
123棉花枯萎菌分子生物学鉴定
采用改良的CTAB的方法[5-6]提取枯萎菌DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的完整度；采用真菌核糖体ITS区段的通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′），对枯萎菌菌株进行PCR扩增。PCR扩增反应液25 μL，05 U/μL Taq聚合酶02 μL，dNTP的浓度为2 mmol/L；引物浓度为2 μmol/L，模板DNA 25 ng。反应条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃ 延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物于琼脂糖凝胶电泳分离，胶回收试剂盒回收产物，T载体连接，连接产物转化大肠杆菌，交由南京金斯瑞生物科技有限公司测序。
124数据分析
通过软件DNAMAN进行序列同源性分析。用NCBI数据库（http：//wwwncbinlmnihgov/）进行BLAST分析，从GeneBank中查找所需物种的不同地区枯萎菌ITS基因序列，通过MEGA 40以最大似然法构建进化树。
125分离棉花枯萎菌菌株致病性分析
棉花枯萎菌接种于查氏液体培养基上，28 ℃恒温摇床培养14 d左右；4层灭菌纱布进行过滤枯萎菌培养液。血球计数板测量枯萎菌的小孢子密度，稀释至100万个/mL；当棉花幼苗生长到1叶1心时，将培养幼苗的塑料杯从托盘上拔起，进行断根，放在枯萎菌菌液中进行侵染，感染后10～20 d开始观察记录。
2结果与分析
21枯萎菌菌落形态检测结果
分离培养的枯萎菌，菌丝白色，菌落蓬松，长势迅速。枯萎病菌的病原菌为尖孢镰刀菌，萎蔫专化型，属于半知菌亚门镰刀属。病原菌在PDA培养基上生长时，菌丝体呈绒毛状或棉絮状，菌落初为白色，后变淡紫色至紫色（图1）。
22枯萎菌显微形态学鉴定
挑去分离的棉花枯萎菌菌丝制作水装片于显微下观察，该菌株产生大型分生孢子，呈镰刀形弯曲，具有3～5个分隔；产生的小型分生孢子多数为单孢，卵圆形。与镰刀分类系统比较，确定为尖孢镰刀菌。
23枯萎菌分子生物学鉴定
231ITS通用引物对菌株的PCR扩增
从图2可以看出，以ITS1、ITS4为引物的PCR扩增产物条带在500～750 bp之间，扩增条带清晰、整齐。 232镰刀菌rDNA ITS区序列比对
商丘的棉花枯萎菌菌株ITS区PCR扩增产物测序得到544 bp的片段，GenBank序列登记号为FJ715505。将该棉花镰刀菌序列和来自世界各地（包括中国在内）的20个具有代表性的镰刀菌属ITS序列进行比较，构建棉花镰刀菌的系统进化树（图3）。从图4可以看出，在全世界范围内，河南商丘棉花镰刀与印度、马来西亚、希腊镰刀菌聚在一起，亲缘很近，而与美国北卡州、法国、墨西哥、澳大利亚菌株亲缘关系稍远，与南韩、哥伦比亚和意大利的亲缘关系最远；在中国范围内，与海南、南宁、贵阳、北京聚在一起，而与台湾、广州、杭州、雅安相距较远，和最近的泰安菌株相距最远。综上结果分析，棉花镰刀菌属亲缘关系远近和地缘远近无密切相关性。
24棉花枯萎菌致病力分析
分离的商丘枯萎菌接种棉花幼苗，对其致病力进行观察分析。幼苗发病时叶片最先表现出症状，叶片边缘或主脉呈现淡黄色不规则斑块，随后病斑逐渐扩大，变成褐色干枯并逐渐向上发展，最终侵染入植株的维管束系统，使整株植株发病死亡（图4）[8]，与田间发病结果一致（图1-a），均为青枯型。
3讨论与结论
核糖体DNA（rDNA）ITS序列的保守性作为植物病原菌的分子鉴定检测手段，已经在植物病害鉴定的研究中得到广泛[CM（25]应用。ITS是介于 18S、58S、28S rDNA 之间的区域， 该区域进化速度较编码区快，在真菌种间存在丰富的变异，在种内不同菌株间又高度保守，该区域DNA核苷酸序列的比较有助于相似种的鉴定。ITS序列已成为系统与进化生物学研究中的重要分子标记，并被广泛应用于亲缘关系较近分类群的系统发育研究[9]。因此，在对棉花枯萎菌形态学研究的基础上进行ITS序列测定可以作为棉花枯萎菌鉴定的辅助手段，为其检测提供快速有效的途径。而进一步利用ITS序列设计种的特异性PCR引物可对棉花枯萎菌进行快速鉴定。
本试验采集河南省商丘地区棉花枯萎病病株，分离出1株棉花枯萎菌单孢菌株进行菌落形态学和显微形态学分析，并采用分子生物学的方法对该菌株核糖体DNA ITS序列进行鉴定，结果表明该菌株为尖孢镰刀菌（F oxysporum），该试验将为进一步的棉花枯萎病的鉴定及防治提供科学的理论依据。
参考文献：
[ZK（#]陈露 棉花枯萎病和黄萎病的鉴别与防治[J] 农技服务，2007，4（4）：70-71
沈其益 中國棉花病害[M] 北京：科学出版社，1993：68-68
[3]张书建，何月秋 介绍一种简单的真菌单孢子分离法[J] 云南农业大学学报，2003，18（3）：26-28
[4]谢宝贵 倒置显微镜单孢分离法[J] 中国食用菌，1996（1）：15-16
[5]庄彩云，李潞滨，胡陶，等 适用于rDNA ITS分析的兰属茵根真菌培养及DNA提取方法[J] 北京农学院学报，2007，22（3）：4-6[HJ17mm]
[6]Zhu Y Y，Wang Y Y，Multani D S，et al The pelationships between DNA polymorphism and geographical origin of Australian isolates of verticillium dahliae from cotton plants[J] Myeosystema，1999，18（3）：366-373
[7]宋瑞清，余江勇，冀瑞卿，等 4个姬松茸菌株rDNA ITS序列比较[J] 林业科技，2007，32（4）：23-27
[8]刘泽辉，武刚，陆进善，等 海陆杂交所选育的长绒棉抗枯萎病研究[J] 新疆农业科学，2007，44（4）：445-449
[9]Mao S，Kenji K，Eiji M，et al Identification of medicinal Atractylodes based on ITS sequences of rDNA[J] Biological
关键词：棉花枯萎菌；单孢分离；ITS序列；致病力；分子鉴定；生物学鉴定；病害防治
中图分类号： S4356212 4文献标志码：
文章编号：1002-1302（2017）16-0086-03
收稿日期：2016-08-04
基金项目：国家自然科学基金（编号：31571997）；河南省高等学校重点科研项目（编号：16A210036）。
作者简介：娄喜艳（1984—），女，河南商丘人，硕士，讲师，从事植物生理学教学与研究。E-mail：lounan2005@163com。
棉花枯萎菌學名尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum），属半知菌亚门镰刀菌属，它是棉花上的重要病害，过去曾作为国内重要植物检疫对象，至今在有些省（市、区）仍作为植物检疫对象。枯萎菌引起的枯萎病在棉花苗期和现蕾期前后常引起大量死苗，残存的病株结铃明显减少，铃质量减轻直接影响棉花生产和棉农收入。此病最早于1892年在美国发现，以后随棉种调运而迅速扩散蔓延，目前在世界各主要产棉国均有发生。我国于1934年在江苏南通和上海川沙等县（市）最早发现此病，20世纪七八十年代初期，遍布全国各主要产棉区，并形成严重危害。20世纪80年代中期以后，随大量抗病品种的推广，枯萎病在我国南北棉区基本得到控制，但局部棉区发生仍然较重，其中特别是新疆棉区常造成大片死亡，目前仍是棉花生产上的一个重要问题。本试验采集河南省商丘地区棉花枯萎病病株，分离棉花枯萎菌单孢菌株，进行菌落形态学和显微形态学分析，并采用分子生物学的方法对该菌株核糖体DNA ITS序列进行鉴定，为进一步的棉花枯萎病的鉴定及防治提供科学的理论依据。
1材料与方法
11材料
河南省民权县采集的棉花枯萎病病株。棉花感病品种为冀棉11，由中国农业科学院棉花研究所提供。
12方法
121棉花枯萎菌的分离和纯化
制备PDA培养基，倒平板；棉花病枝经自来水冲洗，将棉花茎剥皮，在超净工作台上，将其切成长度为10～15 cm的圆柱体，用75%乙醇消毒 30 s 左右，无菌水冲洗，然后用01%氯化汞进行灭菌1 min，用无菌水冲洗2～3次；圆柱体切成4个切片或小薄片，每块组织均应为病健相间变色的维管束组织；放入培养基平板上，轻轻按压，每皿4块，排放均匀；28 ℃恒温箱中培养7～8 d。采用连续稀释法[3]和单孢分离法[4]，纯化分离菌株。
122棉花枯萎病菌形态学鉴定
肉眼观察棉花枯萎菌菌株的菌落形态、生长状况；制备水装片，显微观察棉花枯萎菌菌丝、分生孢子、分生孢子梗等特征。
123棉花枯萎菌分子生物学鉴定
采用改良的CTAB的方法[5-6]提取枯萎菌DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的完整度；采用真菌核糖体ITS区段的通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′），对枯萎菌菌株进行PCR扩增。PCR扩增反应液25 μL，05 U/μL Taq聚合酶02 μL，dNTP的浓度为2 mmol/L；引物浓度为2 μmol/L，模板DNA 25 ng。反应条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃ 延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物于琼脂糖凝胶电泳分离，胶回收试剂盒回收产物，T载体连接，连接产物转化大肠杆菌，交由南京金斯瑞生物科技有限公司测序。
124数据分析
通过软件DNAMAN进行序列同源性分析。用NCBI数据库（http：//wwwncbinlmnihgov/）进行BLAST分析，从GeneBank中查找所需物种的不同地区枯萎菌ITS基因序列，通过MEGA 40以最大似然法构建进化树。
125分离棉花枯萎菌菌株致病性分析
棉花枯萎菌接种于查氏液体培养基上，28 ℃恒温摇床培养14 d左右；4层灭菌纱布进行过滤枯萎菌培养液。血球计数板测量枯萎菌的小孢子密度，稀释至100万个/mL；当棉花幼苗生长到1叶1心时，将培养幼苗的塑料杯从托盘上拔起，进行断根，放在枯萎菌菌液中进行侵染，感染后10～20 d开始观察记录。
2结果与分析
21枯萎菌菌落形态检测结果
分离培养的枯萎菌，菌丝白色，菌落蓬松，长势迅速。枯萎病菌的病原菌为尖孢镰刀菌，萎蔫专化型，属于半知菌亚门镰刀属。病原菌在PDA培养基上生长时，菌丝体呈绒毛状或棉絮状，菌落初为白色，后变淡紫色至紫色（图1）。
22枯萎菌显微形态学鉴定
挑去分离的棉花枯萎菌菌丝制作水装片于显微下观察，该菌株产生大型分生孢子，呈镰刀形弯曲，具有3～5个分隔；产生的小型分生孢子多数为单孢，卵圆形。与镰刀分类系统比较，确定为尖孢镰刀菌。
23枯萎菌分子生物学鉴定
231ITS通用引物对菌株的PCR扩增
从图2可以看出，以ITS1、ITS4为引物的PCR扩增产物条带在500～750 bp之间，扩增条带清晰、整齐。 232镰刀菌rDNA ITS区序列比对
商丘的棉花枯萎菌菌株ITS区PCR扩增产物测序得到544 bp的片段，GenBank序列登记号为FJ715505。将该棉花镰刀菌序列和来自世界各地（包括中国在内）的20个具有代表性的镰刀菌属ITS序列进行比较，构建棉花镰刀菌的系统进化树（图3）。从图4可以看出，在全世界范围内，河南商丘棉花镰刀与印度、马来西亚、希腊镰刀菌聚在一起，亲缘很近，而与美国北卡州、法国、墨西哥、澳大利亚菌株亲缘关系稍远，与南韩、哥伦比亚和意大利的亲缘关系最远；在中国范围内，与海南、南宁、贵阳、北京聚在一起，而与台湾、广州、杭州、雅安相距较远，和最近的泰安菌株相距最远。综上结果分析，棉花镰刀菌属亲缘关系远近和地缘远近无密切相关性。
24棉花枯萎菌致病力分析
分离的商丘枯萎菌接种棉花幼苗，对其致病力进行观察分析。幼苗发病时叶片最先表现出症状，叶片边缘或主脉呈现淡黄色不规则斑块，随后病斑逐渐扩大，变成褐色干枯并逐渐向上发展，最终侵染入植株的维管束系统，使整株植株发病死亡（图4）[8]，与田间发病结果一致（图1-a），均为青枯型。
3讨论与结论
核糖体DNA（rDNA）ITS序列的保守性作为植物病原菌的分子鉴定检测手段，已经在植物病害鉴定的研究中得到广泛[CM（25]应用。ITS是介于 18S、58S、28S rDNA 之间的区域， 该区域进化速度较编码区快，在真菌种间存在丰富的变异，在种内不同菌株间又高度保守，该区域DNA核苷酸序列的比较有助于相似种的鉴定。ITS序列已成为系统与进化生物学研究中的重要分子标记，并被广泛应用于亲缘关系较近分类群的系统发育研究[9]。因此，在对棉花枯萎菌形态学研究的基础上进行ITS序列测定可以作为棉花枯萎菌鉴定的辅助手段，为其检测提供快速有效的途径。而进一步利用ITS序列设计种的特异性PCR引物可对棉花枯萎菌进行快速鉴定。
本试验采集河南省商丘地区棉花枯萎病病株，分离出1株棉花枯萎菌单孢菌株进行菌落形态学和显微形态学分析，并采用分子生物学的方法对该菌株核糖体DNA ITS序列进行鉴定，结果表明该菌株为尖孢镰刀菌（F oxysporum），该试验将为进一步的棉花枯萎病的鉴定及防治提供科学的理论依据。
参考文献：
[ZK（#]陈露 棉花枯萎病和黄萎病的鉴别与防治[J] 农技服务，2007，4（4）：70-71
沈其益 中國棉花病害[M] 北京：科学出版社，1993：68-68
[3]张书建，何月秋 介绍一种简单的真菌单孢子分离法[J] 云南农业大学学报，2003，18（3）：26-28
[4]谢宝贵 倒置显微镜单孢分离法[J] 中国食用菌，1996（1）：15-16
[5]庄彩云，李潞滨，胡陶，等 适用于rDNA ITS分析的兰属茵根真菌培养及DNA提取方法[J] 北京农学院学报，2007，22（3）：4-6[HJ17mm]
[6]Zhu Y Y，Wang Y Y，Multani D S，et al The pelationships between DNA polymorphism and geographical origin of Australian isolates of verticillium dahliae from cotton plants[J] Myeosystema，1999，18（3）：366-373
[7]宋瑞清，余江勇，冀瑞卿，等 4个姬松茸菌株rDNA ITS序列比较[J] 林业科技，2007，32（4）：23-27
[8]刘泽辉，武刚，陆进善，等 海陆杂交所选育的长绒棉抗枯萎病研究[J] 新疆农业科学，2007，44（4）：445-449
[9]Mao S，Kenji K，Eiji M，et al Identification of medicinal Atractylodes based on ITS sequences of rDNA[J] Biological