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摘 要 采用SDS-PAGE电泳技术对银杏雌雄种子蛋白进行研究，结果发现：雌雄种子的胚乳蛋白条带差异明显，雌雄种子的胚体蛋白几乎没有差异；雄种子胚乳蛋白中发现2条雌种子胚乳蛋白没有的谱带。这可以为银杏雌雄树种子的甄别提供指导。
关键词 银杏；雌雄种子；蛋白质；SDS-PAGE电泳
中图分类号：Q944 文献标志码：A 文章编号：1673-890X（2015）13-047-03
知网出版网址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/50.1186.S.20150605.1853.010.html 网络出版时间：2015/6/5 18：53：01
银杏（Ginkgo biloba L.）为裸子植物门银杏纲银杏属植物，是我国特有的古老珍贵树种之一，素有国家“活化石”之称，是国家二级保护植物[1]。从银杏树的外观可以辨别雌雄银杏树，从苗期、叶片、花和花芽、树冠、树枝和物候期方面也可以区分[2]。但从分子方面辨别雌雄种子的研究甚少。银杏种实去掉肉质外种皮后的种核部分俗称白果。雌树种子核果状，果核圆，有二棱，果核头尖；有三棱的种子多发育为雄树[3]。所以，从种核外观上可以区分雌雄种子（图1）。
银杏种子内部由胚体和胚乳组成（图2），白果富含蛋白质、淀粉、糖类和脂肪等物质[4]。白果中蛋白质含量达到80.36%，而糖类等其他物质含量相对较少[5]。银杏种子中蛋白有水溶性、醇溶性、盐溶性、碱溶性之分，而水溶性含量相对较高，其他含量相对较低；同时，储藏种子与萌动种子的蛋白质含量接近，但萌动种子可溶性蛋白质的含量比储藏种子高[6]。
本实验采用当年种子为材料，以双蒸水为溶剂，添加蛋白提取剂，并对雌雄果实的胚体和胚乳的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，从蛋白方面分析银杏雌雄果蛋白条带的差异，为银杏雌雄树种子的甄别提供指导。
1 材料与方法
1.1 材料
银杏雌果和雄果：购买当年银杏果实种子及采摘苏州大学公教楼前银杏树果实。
1.2 主要试剂
蛋白质样品缓冲液，过硫氨酸，四甲基乙二胺。
电泳试剂：分离胶缓冲液与浓缩胶缓冲液，电泳缓冲液（Tris-甘氨酸系统）。
染色试剂：考马斯亮蓝G-250。
脱色试剂：冰乙醇，甲醇，双蒸水。
1.3 方法
1.3.1 材料采集
10月份从银杏树上采摘果实，用碱液去皮法除掉外种皮，置干燥箱干燥后挑选出雌雄种子；同时，购买一批银杏雌雄种子。
1.3.2 雌雄银杏种子胚体和胚乳蛋白样品的制备
（1）研磨：分别称取银杏雌雄种子胚体和胚乳各0.1 g，放入研钵中，加液氮研磨。
（2）水浴：将称好的样品装入离心管中，加入1 mL蛋白提取液，在60℃的条件下水浴30 min，取出冷却静置。
（3）离心：在10000 r/min的条件下离心8 min。
1.3.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳
参考雌雄异株植物银杏特异蛋白初步分析文献，采用单向SDS-PAGE电泳法。首先按照材料比例配制分离胶，用移液管灌注分离胶；待分离胶凝固后，作出记号，再加入浓缩胶，插下1.5 cm宽的梳子；在灌胶时要注意胶面的平整，使胶体结构整齐，留有适度长度的浓缩胶，过少过多都会影响蛋白条带的直顺和清晰度。插梳子时切忌有气泡。待胶体凝固后加入样品，分别加入雌果胚体蛋白、雌果胚乳蛋白、雄果胚体蛋白、雄果胚乳蛋白，加入电泳液，内部加满、外部半满即可。电泳时电泳液的纯度会影响电泳效果，如果电泳液已经使用多次污染严重或是放置已久，需及时更换。接上电泳仪，浓缩胶电压80～90 V，分离胶电压120～130 V，指示剂迁移至距下沿约1.5 cm时停止电泳。电泳结束后取出凝胶，用染色液染色。
1.3.4 染色
凝胶用染色液染色大约15 min，倒去染色液用脱色液脱色，在摇床上摇晃以加强脱色效果。应注意及时更新脱色液，保证脱色效果。脱色后用蒸馏水漂洗，然后拍照。
2 结果与分析
2.1 银杏雌雄种子胚乳蛋白的分析
图3显示，从左向右第1、2条蛋白条带是胚乳蛋白条带，第1条条带是雌种子胚乳蛋白，第2条条带是雄种子胚乳蛋白，从图中可知雌雄胚乳间蛋白条带有明显差异。雄胚乳比雌胚乳多了2条蛋白条带，如图中箭头所示。
2.2 银杏雌雄种子胚体蛋白的分析
图3显示，从左向右第3、4条蛋白条带是胚体蛋白条带，第3条条带是雌种子胚体蛋白，第4条条带是雄种子胚体蛋白，从图可知雌雄种子胚体和胚乳之间的蛋白没有明显差异。
3 讨论
3.1 银杏种子材料适宜的准备时期
银杏胚珠于4月初开始发生，至4月份大部分胚珠产生传粉滴，此时为传粉受粉的最佳时期[7]。银杏的传粉与受精作用相距近5个月，至8月30日左右，种皮和胚乳的发育已近成熟，这时才进入受精作用的高峰期，受精卵形成并发育为胚[8]。所以，确定9月底10月份为合适的采摘时期。
3.2 蛋白条带差异说明
基因决定蛋白质的生成，雌雄银杏种子胚乳间的蛋白差异条带说明了雌雄种子基因间的差异，差异基因决定雌雄种子胚乳蛋白的差异，可以为从蛋白水平辨别银杏的雌雄提供参考依据。
3.3 凝胶比例
不同的凝胶比例可以迁移出不同长度的蛋白条带，对于聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离胶浓度越大分离蛋白的分子量就越小。分离胶浓度太大，分子量大的蛋白质分不开，太小则分子量小的蛋白质难以分开[9]。从图3可知在分离胶的最上方有一些条带还未完全迁移开，可以通过这些蛋白谱带上的条带所代表的蛋白长度大小来选择适合浓度比例的凝胶，以探知是否还有其他差异蛋白条带。也可改进方法，采用双向电泳技术迁移出更多的蛋白条带。
参考文献：
[1] 黄文，谢笔钧.白果蛋白质的分离、纯化、理化特性及其抗氧化性活性研究[J].中国农业科学，2004，37（10）：1537-1543.
[2] 胡一民.雌雄银杏巧区别[J].安徽农业，1996，（10）：11.
[3] 梁立兴.中国银杏[M].济南：山东科学技术出版社，1988.
[4] 林睦就，张云跃.我国银杏遗传变异研究之二：种仁营养成分和无机元素含量的变异[J].林业科学，2002，38（2）：157-161.
[5] 孙小斐，乔玉辉.白果蛋白的提取分离及其等电点的测定[J].食品工业，2012，33（9）：156-157.
[6] 梁红，徐斌，潘伟民，等.银杏种子和叶的蛋白分析[J].植物资源与环境学报，2000，9（4）：5-8.
[7] 王莉，王水平，汪琼，等.银杏胚珠发育进程的解剖學研究[J].西北植物学报，2007，27（7）：1349-1356.
[8] 于新，冯彤，庞杰.不同时期银杏种子成分及呼吸变化[J].仲恺农业技术学院学报，1998，11（2）：19-23.
[9] 杨金华，付庆云.雌雄异株植物银杏特异蛋白初步分析[J].科技信息，2012，（31）：241-241.
（责任编辑：丁志祥）
关键词 银杏；雌雄种子；蛋白质；SDS-PAGE电泳
中图分类号：Q944 文献标志码：A 文章编号：1673-890X（2015）13-047-03
知网出版网址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/50.1186.S.20150605.1853.010.html 网络出版时间：2015/6/5 18：53：01
银杏（Ginkgo biloba L.）为裸子植物门银杏纲银杏属植物，是我国特有的古老珍贵树种之一，素有国家“活化石”之称，是国家二级保护植物[1]。从银杏树的外观可以辨别雌雄银杏树，从苗期、叶片、花和花芽、树冠、树枝和物候期方面也可以区分[2]。但从分子方面辨别雌雄种子的研究甚少。银杏种实去掉肉质外种皮后的种核部分俗称白果。雌树种子核果状，果核圆，有二棱，果核头尖；有三棱的种子多发育为雄树[3]。所以，从种核外观上可以区分雌雄种子（图1）。
银杏种子内部由胚体和胚乳组成（图2），白果富含蛋白质、淀粉、糖类和脂肪等物质[4]。白果中蛋白质含量达到80.36%，而糖类等其他物质含量相对较少[5]。银杏种子中蛋白有水溶性、醇溶性、盐溶性、碱溶性之分，而水溶性含量相对较高，其他含量相对较低；同时，储藏种子与萌动种子的蛋白质含量接近，但萌动种子可溶性蛋白质的含量比储藏种子高[6]。
本实验采用当年种子为材料，以双蒸水为溶剂，添加蛋白提取剂，并对雌雄果实的胚体和胚乳的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，从蛋白方面分析银杏雌雄果蛋白条带的差异，为银杏雌雄树种子的甄别提供指导。
1 材料与方法
1.1 材料
银杏雌果和雄果：购买当年银杏果实种子及采摘苏州大学公教楼前银杏树果实。
1.2 主要试剂
蛋白质样品缓冲液，过硫氨酸，四甲基乙二胺。
电泳试剂：分离胶缓冲液与浓缩胶缓冲液，电泳缓冲液（Tris-甘氨酸系统）。
染色试剂：考马斯亮蓝G-250。
脱色试剂：冰乙醇，甲醇，双蒸水。
1.3 方法
1.3.1 材料采集
10月份从银杏树上采摘果实，用碱液去皮法除掉外种皮，置干燥箱干燥后挑选出雌雄种子；同时，购买一批银杏雌雄种子。
1.3.2 雌雄银杏种子胚体和胚乳蛋白样品的制备
（1）研磨：分别称取银杏雌雄种子胚体和胚乳各0.1 g，放入研钵中，加液氮研磨。
（2）水浴：将称好的样品装入离心管中，加入1 mL蛋白提取液，在60℃的条件下水浴30 min，取出冷却静置。
（3）离心：在10000 r/min的条件下离心8 min。
1.3.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳
参考雌雄异株植物银杏特异蛋白初步分析文献，采用单向SDS-PAGE电泳法。首先按照材料比例配制分离胶，用移液管灌注分离胶；待分离胶凝固后，作出记号，再加入浓缩胶，插下1.5 cm宽的梳子；在灌胶时要注意胶面的平整，使胶体结构整齐，留有适度长度的浓缩胶，过少过多都会影响蛋白条带的直顺和清晰度。插梳子时切忌有气泡。待胶体凝固后加入样品，分别加入雌果胚体蛋白、雌果胚乳蛋白、雄果胚体蛋白、雄果胚乳蛋白，加入电泳液，内部加满、外部半满即可。电泳时电泳液的纯度会影响电泳效果，如果电泳液已经使用多次污染严重或是放置已久，需及时更换。接上电泳仪，浓缩胶电压80～90 V，分离胶电压120～130 V，指示剂迁移至距下沿约1.5 cm时停止电泳。电泳结束后取出凝胶，用染色液染色。
1.3.4 染色
凝胶用染色液染色大约15 min，倒去染色液用脱色液脱色，在摇床上摇晃以加强脱色效果。应注意及时更新脱色液，保证脱色效果。脱色后用蒸馏水漂洗，然后拍照。
2 结果与分析
2.1 银杏雌雄种子胚乳蛋白的分析
图3显示，从左向右第1、2条蛋白条带是胚乳蛋白条带，第1条条带是雌种子胚乳蛋白，第2条条带是雄种子胚乳蛋白，从图中可知雌雄胚乳间蛋白条带有明显差异。雄胚乳比雌胚乳多了2条蛋白条带，如图中箭头所示。
2.2 银杏雌雄种子胚体蛋白的分析
图3显示，从左向右第3、4条蛋白条带是胚体蛋白条带，第3条条带是雌种子胚体蛋白，第4条条带是雄种子胚体蛋白，从图可知雌雄种子胚体和胚乳之间的蛋白没有明显差异。
3 讨论
3.1 银杏种子材料适宜的准备时期
银杏胚珠于4月初开始发生，至4月份大部分胚珠产生传粉滴，此时为传粉受粉的最佳时期[7]。银杏的传粉与受精作用相距近5个月，至8月30日左右，种皮和胚乳的发育已近成熟，这时才进入受精作用的高峰期，受精卵形成并发育为胚[8]。所以，确定9月底10月份为合适的采摘时期。
3.2 蛋白条带差异说明
基因决定蛋白质的生成，雌雄银杏种子胚乳间的蛋白差异条带说明了雌雄种子基因间的差异，差异基因决定雌雄种子胚乳蛋白的差异，可以为从蛋白水平辨别银杏的雌雄提供参考依据。
3.3 凝胶比例
不同的凝胶比例可以迁移出不同长度的蛋白条带，对于聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离胶浓度越大分离蛋白的分子量就越小。分离胶浓度太大，分子量大的蛋白质分不开，太小则分子量小的蛋白质难以分开[9]。从图3可知在分离胶的最上方有一些条带还未完全迁移开，可以通过这些蛋白谱带上的条带所代表的蛋白长度大小来选择适合浓度比例的凝胶，以探知是否还有其他差异蛋白条带。也可改进方法，采用双向电泳技术迁移出更多的蛋白条带。
参考文献：
[1] 黄文，谢笔钧.白果蛋白质的分离、纯化、理化特性及其抗氧化性活性研究[J].中国农业科学，2004，37（10）：1537-1543.
[2] 胡一民.雌雄银杏巧区别[J].安徽农业，1996，（10）：11.
[3] 梁立兴.中国银杏[M].济南：山东科学技术出版社，1988.
[4] 林睦就，张云跃.我国银杏遗传变异研究之二：种仁营养成分和无机元素含量的变异[J].林业科学，2002，38（2）：157-161.
[5] 孙小斐，乔玉辉.白果蛋白的提取分离及其等电点的测定[J].食品工业，2012，33（9）：156-157.
[6] 梁红，徐斌，潘伟民，等.银杏种子和叶的蛋白分析[J].植物资源与环境学报，2000，9（4）：5-8.
[7] 王莉，王水平，汪琼，等.银杏胚珠发育进程的解剖學研究[J].西北植物学报，2007，27（7）：1349-1356.
[8] 于新，冯彤，庞杰.不同时期银杏种子成分及呼吸变化[J].仲恺农业技术学院学报，1998，11（2）：19-23.
[9] 杨金华，付庆云.雌雄异株植物银杏特异蛋白初步分析[J].科技信息，2012，（31）：241-241.
（责任编辑：丁志祥）