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摘 要：本文建立了快速溶剂萃取-高效液相色谱法测定花生中克百威和3-羟基克百威残留量的方法。结果表明：克百威和3-羟基克百威在0.02～1.00 mg/L浓度范围内线性关系好，相关系数在0.999以上。在0.01～0.10 mg/kg水平加标回收，回收率为86.3%～97.2%，相对标准偏差为1.22%～4.73%（n=6），方法的检出限为0.01 mg/kg。该方法适用于花生中克百威残留量的检测。
关键词：克百威;3-羟基克百威;快速溶剂萃取;高效液相色谱法
克百威、3-羟基克百威等农药常用于花生的种植和生长过程中，它们能防治多种害虫。《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》（GB 2763—2019）中规定，花生中克百威的限量为0.2 mg/kg，其中克百威的残留量包含克百威和3-羟基克百威。克百威和3-羟基克百威是广谱性杀虫、杀线虫剂，具有触杀和胃毒作用。它與胆碱酯酶结合不可逆，因此毒性较高[1]。对花生中的克百威残留量进行检测和监控，显得尤为重要。
目前检测克百威的方法有气相色谱法[2-3]、气相色谱-质谱法[4-5]、荧光检测器-高效液相色谱法[6-9]、紫外检测器-高效液相色谱法[10-11]、高效液相色谱-质谱法[12-15]等。目前比较常用的是荧光检测器-高效液相色谱法，该方法灵敏度高，仪器配备要求不高。提取花生中克百威的方法有索氏提取、超声波辅助提取、振荡提取等，但过程烦琐、周期长，不利于大批量检测。快速溶剂萃取是近几年发展起来的一种在高温、高压条件下快速提取固体或半固体样品的前处理方法，具有快速高效的特点，已在多个领域广泛应用[16]。本文采用快速溶剂萃取的方法提取花生中的克百威和3-羟基克百威，用高效液相色谱-柱后衍生法检测。该方法操作简单，自动化程度高，适宜于批量检测工作。
1 材料与方法
1.1 原料与试剂
花生：市售，硅胶，硅藻土，乙腈（色谱纯，thermo），甲醇（色谱纯，thermo），丙酮（色谱纯，thermo），OPA溶液（美国Pickering公司），氢氧化钠溶液（美国Pickering公司），邻苯二甲醛（美国Pickering公司），巯基乙醇（美国Pickering公司），克百威、3-羟基克百威标准品（农业部标准品，浓度100 mg/L），超纯水。
1.2 仪器与设备
分析天平，玻璃研钵和研杵，旋转蒸发仪，快速溶剂萃取仪，带柱后衍生系统的高效液相色谱仪，Mili-Q纯水系统。
1.3 实验方法
1.3.1 液相色谱条件
（1）衍生条件。水解试剂流量0.3mL/min，OPA试剂流量0.3mL/min，水解温度100℃，衍生温度为室温。
（2）色谱条件。C18柱（安捷伦Eclipe Pluse 4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温：42 ℃，流量1.0 mL/min进样量：10 ?L，流动相：A为甲醇，B为水。梯度洗脱程序：0～10 min时，B由80%降至45%;10～19 min时，B由45%降至20%，19～20 min B由20%升至80%;20～25 min B为80%。激发波长为339 nm，发射波长为445 nm.
1.3.2 快速溶剂萃取条件
溶剂：乙腈;温度：100 ℃;萃取压力：10 MPa;加热时间：300 s;静态时间：180 s;淋洗体积：40%;吹扫时间：100 s;循环次数：3次。
1.3.3 标准溶液配制
准确移取1 mL的克百威、3-羟基克百威标准溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度得到10 mg/L的标准储备液，用甲醇水溶液（1+1）逐级稀释，得到0.02 mg/L、0.04 mg/L、0.10 mg/L、0.20 mg/L、0.40 mg/L和1.00 mg/L标准的工作液。
1.3.4 样品前处理
称取粉碎均匀的花生样品5.0 g和5 g硅胶，放入干净玻璃研钵种充分混合均匀，然后装入33 mL萃取池中，加入1 g硅藻土填满萃取池。装好萃取池后，放入快速溶剂萃取系统中按照1.3.2的条件进行萃取。将萃取液转移至鸡心瓶中，45 ℃下旋转蒸发至近干。用2.5 mL甲醇定容，过0.22 μm的有机滤膜，待上机检测。
2 结果分析
2.1 萃取溶剂的选择
萃取溶剂是影响萃取效率重要因素之一。本实验选用丙酮和乙腈两种有机试剂比对回收率的大小。经过实验发现丙酮提取时，能把花生中的油提取出来，影响定容，并且杂质干扰多。乙腈萃取效果好，回收率高，因此选用乙腈为萃取溶剂。
2.2 流动相的选择
流动相参考（NY/T 761—2008）中用到的甲醇和水，采用等度洗脱时，3-羟基克百威的的保留时间比较靠前，而克百威的保留时间比较靠后，两者的保留时间相差比较大。因此采用梯度洗脱，前期甲醇的比例小，使3-羟基克百威的保留时间拖后，后期甲醇浓度增大，克百威出峰时间提前。这样既能使目标物与杂质分离开来，又能保证一个样品的分析时间不会太长。
2.3 线性范围和检出限
按照1.3.3制备的混合标准溶液，在优化的色谱条件下，以峰面积为纵坐标，3-羟基克百威和克百威的含量（质量浓度）为横坐标，绘制工作曲线，在0.02～1.00 mg/L质量浓度范围内，浓度与色谱峰面积线性关系良好，且相关系数均大于0.999。以信噪比（S/N）的3倍计算检出限，在取样为5 g时，克百威、3-羟基克百威的检出限为0.01 mg/kg。校准曲线方程见表1所示。
2.4 精密度和加标回收实验
取空白的花生样品进行加标实验，加标浓度如表2所示，按照1.3.4样品前处理方法对加标样品进行前处理，按照1.3.1色谱条件进行测定，每个加标质量浓度水平平行测定6次。添加回收率实验结果见下表2。 3 结论
本文建立了快速溶剂萃取-高效液相色谱法测定花生中的克百威，该方法操作简单，有机试剂用量少，自动化程度高，适用于批量检测工作。实验结果表明，克百威和3-羟基克百威在0.02～1.0 mg/L浓度范围内线性关系好，相关系数在0.999以上，在0.01～0.10mg/kg加标水平时，回收率为86.3%～97.2%，相对标准偏差为1.22%～4.73%（n=6），方法的检出限为0.01 mg/kg。该方法适用于花生中克百威残留量的检测。
参考文献
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[3]谭头云，蔡磊明，贾福艳，等.气相色谱法测定大豆中克百威及其代谢物的残留量[J].农药，2009，48（1）：58-59.
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[5]褚能明，杨俊英，李典宴，等.气相色谱-串联质谱法测定露地芹菜中丁硫克百威及其代谢物残留[J].南方农业学报，2019，50（8）：1822-1828.
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[10]何丛薇，李亚丽，高文惠.高效液相色谱法同时检测饲料中6种农药残留[J].中国饲料，2015（15）：26-28.
[11]吴新华，冯何松，周盾白.活性炭净化-高效液相色谱法检测蔬菜中氨基甲酸酯类农药残留[J].中国蔬菜，2020（3）：67-70.
[12]姚丽君，杨璐，代弟，等.液相色谱-串联质谱法同时检测蔬菜中克百威和3-羟基克百威残留[J].食品安全质量检测学报，2017（4）：294-299.
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[14]姚清华，李捷，柯秋璇，等.固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法同时测定银耳中的8种农药残留[J].分析科学学报，2020，36（1）：106-110.
[15]叶玲，区硕俊，岑建斌，等.DLLME-UPLC-TOF-MS法测定新鲜果汁中5种氨基甲酸酯类农药[J].食品研究与开发，2019，40（14）：176-181.
[16]胡红芳，刘全斌，苏璞，等.快速溶剂萃取-液相色谱法测定大豆中甲萘威残留[J].解放军预防医学杂志，2014，32（5）：459.
关键词：克百威;3-羟基克百威;快速溶剂萃取;高效液相色谱法
克百威、3-羟基克百威等农药常用于花生的种植和生长过程中，它们能防治多种害虫。《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》（GB 2763—2019）中规定，花生中克百威的限量为0.2 mg/kg，其中克百威的残留量包含克百威和3-羟基克百威。克百威和3-羟基克百威是广谱性杀虫、杀线虫剂，具有触杀和胃毒作用。它與胆碱酯酶结合不可逆，因此毒性较高[1]。对花生中的克百威残留量进行检测和监控，显得尤为重要。
目前检测克百威的方法有气相色谱法[2-3]、气相色谱-质谱法[4-5]、荧光检测器-高效液相色谱法[6-9]、紫外检测器-高效液相色谱法[10-11]、高效液相色谱-质谱法[12-15]等。目前比较常用的是荧光检测器-高效液相色谱法，该方法灵敏度高，仪器配备要求不高。提取花生中克百威的方法有索氏提取、超声波辅助提取、振荡提取等，但过程烦琐、周期长，不利于大批量检测。快速溶剂萃取是近几年发展起来的一种在高温、高压条件下快速提取固体或半固体样品的前处理方法，具有快速高效的特点，已在多个领域广泛应用[16]。本文采用快速溶剂萃取的方法提取花生中的克百威和3-羟基克百威，用高效液相色谱-柱后衍生法检测。该方法操作简单，自动化程度高，适宜于批量检测工作。
1 材料与方法
1.1 原料与试剂
花生：市售，硅胶，硅藻土，乙腈（色谱纯，thermo），甲醇（色谱纯，thermo），丙酮（色谱纯，thermo），OPA溶液（美国Pickering公司），氢氧化钠溶液（美国Pickering公司），邻苯二甲醛（美国Pickering公司），巯基乙醇（美国Pickering公司），克百威、3-羟基克百威标准品（农业部标准品，浓度100 mg/L），超纯水。
1.2 仪器与设备
分析天平，玻璃研钵和研杵，旋转蒸发仪，快速溶剂萃取仪，带柱后衍生系统的高效液相色谱仪，Mili-Q纯水系统。
1.3 实验方法
1.3.1 液相色谱条件
（1）衍生条件。水解试剂流量0.3mL/min，OPA试剂流量0.3mL/min，水解温度100℃，衍生温度为室温。
（2）色谱条件。C18柱（安捷伦Eclipe Pluse 4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温：42 ℃，流量1.0 mL/min进样量：10 ?L，流动相：A为甲醇，B为水。梯度洗脱程序：0～10 min时，B由80%降至45%;10～19 min时，B由45%降至20%，19～20 min B由20%升至80%;20～25 min B为80%。激发波长为339 nm，发射波长为445 nm.
1.3.2 快速溶剂萃取条件
溶剂：乙腈;温度：100 ℃;萃取压力：10 MPa;加热时间：300 s;静态时间：180 s;淋洗体积：40%;吹扫时间：100 s;循环次数：3次。
1.3.3 标准溶液配制
准确移取1 mL的克百威、3-羟基克百威标准溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度得到10 mg/L的标准储备液，用甲醇水溶液（1+1）逐级稀释，得到0.02 mg/L、0.04 mg/L、0.10 mg/L、0.20 mg/L、0.40 mg/L和1.00 mg/L标准的工作液。
1.3.4 样品前处理
称取粉碎均匀的花生样品5.0 g和5 g硅胶，放入干净玻璃研钵种充分混合均匀，然后装入33 mL萃取池中，加入1 g硅藻土填满萃取池。装好萃取池后，放入快速溶剂萃取系统中按照1.3.2的条件进行萃取。将萃取液转移至鸡心瓶中，45 ℃下旋转蒸发至近干。用2.5 mL甲醇定容，过0.22 μm的有机滤膜，待上机检测。
2 结果分析
2.1 萃取溶剂的选择
萃取溶剂是影响萃取效率重要因素之一。本实验选用丙酮和乙腈两种有机试剂比对回收率的大小。经过实验发现丙酮提取时，能把花生中的油提取出来，影响定容，并且杂质干扰多。乙腈萃取效果好，回收率高，因此选用乙腈为萃取溶剂。
2.2 流动相的选择
流动相参考（NY/T 761—2008）中用到的甲醇和水，采用等度洗脱时，3-羟基克百威的的保留时间比较靠前，而克百威的保留时间比较靠后，两者的保留时间相差比较大。因此采用梯度洗脱，前期甲醇的比例小，使3-羟基克百威的保留时间拖后，后期甲醇浓度增大，克百威出峰时间提前。这样既能使目标物与杂质分离开来，又能保证一个样品的分析时间不会太长。
2.3 线性范围和检出限
按照1.3.3制备的混合标准溶液，在优化的色谱条件下，以峰面积为纵坐标，3-羟基克百威和克百威的含量（质量浓度）为横坐标，绘制工作曲线，在0.02～1.00 mg/L质量浓度范围内，浓度与色谱峰面积线性关系良好，且相关系数均大于0.999。以信噪比（S/N）的3倍计算检出限，在取样为5 g时，克百威、3-羟基克百威的检出限为0.01 mg/kg。校准曲线方程见表1所示。
2.4 精密度和加标回收实验
取空白的花生样品进行加标实验，加标浓度如表2所示，按照1.3.4样品前处理方法对加标样品进行前处理，按照1.3.1色谱条件进行测定，每个加标质量浓度水平平行测定6次。添加回收率实验结果见下表2。 3 结论
本文建立了快速溶剂萃取-高效液相色谱法测定花生中的克百威，该方法操作简单，有机试剂用量少，自动化程度高，适用于批量检测工作。实验结果表明，克百威和3-羟基克百威在0.02～1.0 mg/L浓度范围内线性关系好，相关系数在0.999以上，在0.01～0.10mg/kg加标水平时，回收率为86.3%～97.2%，相对标准偏差为1.22%～4.73%（n=6），方法的检出限为0.01 mg/kg。该方法适用于花生中克百威残留量的检测。
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