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【摘 要】目的：探讨一氧化氮在急性出血坏死性胰腺炎时对肝脏枯否细胞bcl-2和BaX基因的作用调控肝脏枯否细胞的凋亡。方法：通过对SD大鼠支撑胰腺炎模型后，不同的处理手段，采点处死后，对肝脏枯否细胞bcl-2和BaX基因表达的评分、肝脏枯否细胞凋亡指数、淀粉酶和一氧化氮关系的比较。结果：一氧化氮可以通过早期启动肝脏枯否细胞的凋亡基因的激活，抑制抑凋亡基因的表达，促使枯否细胞的凋亡。结论：NO通过调节BaX、bcl-2等凋亡相关基因，调控肝脏枯否细胞的凋亡。
【关键词】一氧化氮；急性出血坏死胰腺炎；肝脏枯否细胞，bcl-2；BaX 凋亡
【文章编号】1004-7484（2014）05-2938-02
急性出血坏死胰腺炎起病急，治疗难度大，并发症多，其发病机制尚不完全清楚急性出血坏死性胰腺炎（AHNP）起病急骤，治疗难度大，并发症多，病死率高。确切的发病机制患者尚不完全清楚。肝脏枯否细胞是全身数量最多的巨噬细胞群落，主要作用是吞噬门静脉来源的内毒素，发挥“生物滤膜”作用。现对一氧化氮在急性出血坏死性胰腺炎时对肝脏枯否细胞bcl-2和BaX基因的作用，希望对治疗有所启示。
1 材料和方法
1.1 材料：bcl-2、BaX试剂盒由背景中山生物技术购买。普通光学显微镜，日本Olympus。全自动生化分析仪：芬兰KONE公司产。L-NAME、L-arg由Sigma公司购买。
1.2 方法：急性出血坏死性胰腺炎模型制备：大鼠禁食水12h，用2%戊巴妥钠（40mg/kg）肌注麻醉。模型参照Aho等方法无菌操作，正中切口，剖开腹腔，在胆管和胰管入十二指肠处做临時性结扎，穿刺胰管，向胆管内加压注入1.5%去氧胆酸钠（0.05mg/100g），注射10min后，去除结扎线，关闭腹腔，将大鼠放入笼中饲养，自由进水。术前准备同上，剖开腹腔后，轻轻翻动胰腺，随即关腹。分组设计：所有动物共120只，雌雄各半，随即分为四组，第一组为假手术组（SOG）；第二组为急性出血坏死性胰腺炎组（APG）；第三组为制备AHNP后立即舌下静脉注射L-NAME（2.5%，25mg/kg）组，即L-NAME组；第四组为制成AHNP后，立即舌下静脉注射L-arg（400mg/kg）组，即L-arg组。形态学观察：在术后6h、12h、24h采点处死后，取动物胰腺及肝脏门静脉血管窦壁用10%福尔马林液固定标本，石蜡包埋切片，分别进行病理评分，肝脏枯否细胞bcl-2，BaX及凋亡免疫组织化学实验。观察指标：（1）光镜下胰腺组织病理学评分：对胰腺标本根据水肿炎症细胞浸润、出血、坏死和腺泡细胞空泡化形成进行病理组织学评分。（2）取肝脏门静脉血管窦壁上圆形细胞， bcl-2，BaX按试剂盒说明进行，bcl-2基因表达阳性为细胞浆内出现棕黄色颗粒。细胞凋亡指数：取高倍视野（×400）计算每500个细胞中的阳性细胞所占的百分比，进行反差分析及q检验。用德国KONTRONIBAS2个自动图像分析系统进行灰度分析，进行统计学处理。
1.3 数据处理：血清淀粉酶采用反差分析及q检验，P<0.05为差异有统计学意义。bcl-2，BaX细胞浆被染色成棕黄色为阳性细胞。用德国KONTRON全自动图像分析系统进行灰度分析，并用申洪方法换算成阳性单（PU）进行统计学处理。
2 结果
结果见表1-3。
3 结论
一氧化氮是一种小分子气体。近年来研究发现其作为一种新型的信号分子，对细胞的凋亡起着重要作用。
本实验采用不同的处理后，分别观察SD大鼠的血清淀粉酶、胰腺病理评分、bcl-2、BaX等指标。认为：（1）胰淀粉酶：胰腺炎时呈上升趋势，均比SOG相应时高。应用一氧化氮合酶抑制剂L-NAME后，血清淀粉酶更高；相反L-arg应用后，呈下降趋势。（2）胰腺病理评分；APG在24h后比12h变化明显（P<0.05），应用L-arg则相反。（3）肝脏枯否细胞促凋亡基因BaX在L-arg时表达明显；在L-NAME时表达下降。抑凋亡基因bcl-2 在 L-arg时表达下降，在L-NAME时表达明显且差异有统计学意义。（4）凋亡指数：应用L-arg时则明显增多。
综上所述，我们研究证明，一氧化氮通过调节BaX 、bcl-2等凋亡相关基因，调控肝脏枯否细胞的凋亡。肝脏枯否细胞是全身数量最多的巨噬细胞群落，主要作用是吞噬门静脉来源的内毒素，发挥“生物滤膜”作用。一氧化氮在急性出血坏死性胰腺炎时对肝脏枯否细胞bcl-2和BaX基因的调控，促使肝脏枯否细胞凋亡。
参考文献
[1] Flavahan NA，van Houtle PM. Mechanisms underlying the inhibitory interaction between the nitrioxide vasodilator SIN-1 and the endothelium.J.Cardiovase Pharnacol，1989，14（Suppl 11）：s86-s90.
[2] 张登海.一氧化氮合成酶分子生物学进展.生命科学，1994，17（3）：25-28.
[3] 申洪.免疫组织化学染色定量方法研究（Ⅲ）.中国组织化学与细胞化学杂志，1995，4：89-91.
【关键词】一氧化氮；急性出血坏死胰腺炎；肝脏枯否细胞，bcl-2；BaX 凋亡
【文章编号】1004-7484（2014）05-2938-02
急性出血坏死胰腺炎起病急，治疗难度大，并发症多，其发病机制尚不完全清楚急性出血坏死性胰腺炎（AHNP）起病急骤，治疗难度大，并发症多，病死率高。确切的发病机制患者尚不完全清楚。肝脏枯否细胞是全身数量最多的巨噬细胞群落，主要作用是吞噬门静脉来源的内毒素，发挥“生物滤膜”作用。现对一氧化氮在急性出血坏死性胰腺炎时对肝脏枯否细胞bcl-2和BaX基因的作用，希望对治疗有所启示。
1 材料和方法
1.1 材料：bcl-2、BaX试剂盒由背景中山生物技术购买。普通光学显微镜，日本Olympus。全自动生化分析仪：芬兰KONE公司产。L-NAME、L-arg由Sigma公司购买。
1.2 方法：急性出血坏死性胰腺炎模型制备：大鼠禁食水12h，用2%戊巴妥钠（40mg/kg）肌注麻醉。模型参照Aho等方法无菌操作，正中切口，剖开腹腔，在胆管和胰管入十二指肠处做临時性结扎，穿刺胰管，向胆管内加压注入1.5%去氧胆酸钠（0.05mg/100g），注射10min后，去除结扎线，关闭腹腔，将大鼠放入笼中饲养，自由进水。术前准备同上，剖开腹腔后，轻轻翻动胰腺，随即关腹。分组设计：所有动物共120只，雌雄各半，随即分为四组，第一组为假手术组（SOG）；第二组为急性出血坏死性胰腺炎组（APG）；第三组为制备AHNP后立即舌下静脉注射L-NAME（2.5%，25mg/kg）组，即L-NAME组；第四组为制成AHNP后，立即舌下静脉注射L-arg（400mg/kg）组，即L-arg组。形态学观察：在术后6h、12h、24h采点处死后，取动物胰腺及肝脏门静脉血管窦壁用10%福尔马林液固定标本，石蜡包埋切片，分别进行病理评分，肝脏枯否细胞bcl-2，BaX及凋亡免疫组织化学实验。观察指标：（1）光镜下胰腺组织病理学评分：对胰腺标本根据水肿炎症细胞浸润、出血、坏死和腺泡细胞空泡化形成进行病理组织学评分。（2）取肝脏门静脉血管窦壁上圆形细胞， bcl-2，BaX按试剂盒说明进行，bcl-2基因表达阳性为细胞浆内出现棕黄色颗粒。细胞凋亡指数：取高倍视野（×400）计算每500个细胞中的阳性细胞所占的百分比，进行反差分析及q检验。用德国KONTRONIBAS2个自动图像分析系统进行灰度分析，进行统计学处理。
1.3 数据处理：血清淀粉酶采用反差分析及q检验，P<0.05为差异有统计学意义。bcl-2，BaX细胞浆被染色成棕黄色为阳性细胞。用德国KONTRON全自动图像分析系统进行灰度分析，并用申洪方法换算成阳性单（PU）进行统计学处理。
2 结果
结果见表1-3。
3 结论
一氧化氮是一种小分子气体。近年来研究发现其作为一种新型的信号分子，对细胞的凋亡起着重要作用。
本实验采用不同的处理后，分别观察SD大鼠的血清淀粉酶、胰腺病理评分、bcl-2、BaX等指标。认为：（1）胰淀粉酶：胰腺炎时呈上升趋势，均比SOG相应时高。应用一氧化氮合酶抑制剂L-NAME后，血清淀粉酶更高；相反L-arg应用后，呈下降趋势。（2）胰腺病理评分；APG在24h后比12h变化明显（P<0.05），应用L-arg则相反。（3）肝脏枯否细胞促凋亡基因BaX在L-arg时表达明显；在L-NAME时表达下降。抑凋亡基因bcl-2 在 L-arg时表达下降，在L-NAME时表达明显且差异有统计学意义。（4）凋亡指数：应用L-arg时则明显增多。
综上所述，我们研究证明，一氧化氮通过调节BaX 、bcl-2等凋亡相关基因，调控肝脏枯否细胞的凋亡。肝脏枯否细胞是全身数量最多的巨噬细胞群落，主要作用是吞噬门静脉来源的内毒素，发挥“生物滤膜”作用。一氧化氮在急性出血坏死性胰腺炎时对肝脏枯否细胞bcl-2和BaX基因的调控，促使肝脏枯否细胞凋亡。
参考文献
[1] Flavahan NA，van Houtle PM. Mechanisms underlying the inhibitory interaction between the nitrioxide vasodilator SIN-1 and the endothelium.J.Cardiovase Pharnacol，1989，14（Suppl 11）：s86-s90.
[2] 张登海.一氧化氮合成酶分子生物学进展.生命科学，1994，17（3）：25-28.
[3] 申洪.免疫组织化学染色定量方法研究（Ⅲ）.中国组织化学与细胞化学杂志，1995，4：89-91.