论文部分内容阅读
摘 要：本实验采用酶法对头孢氨苄合成工艺进行研究。最佳工艺为投酶量1.8KU/L，PGM与7-ADCA比例为1.2：1，PH值为6.5，合成反应温度分别为17摄氏度的条件下，合成反应时间分别2.5小时。
关键词：酶法；合成；研究
头孢羟氨苄为β-内酰胺类抗生素，对产青霉素酶和不产青霉素酶的金葡菌，凝固酶阴性葡萄球菌、肺炎链球菌、A组溶血性链球菌等大部分菌株具良好抗菌作用[1-5]。头孢羟氨苄主要用于泌尿道、胆道、及呼吸道等感染和敏感菌的所致的泌尿道、生殖道、呼吸道、皮肤软组织感染，也常用于中耳炎。酶法合成就酶催化反应与化学反应比较来看，酶反应的优点是专一性高，特别是对于立体异构；条件温和，常温常压，不需要耐高温高压的设备；催化速率高[6-8]。但酶一般来说较贵；由于酶的专一性高适用性小；由于一般的酶来自于生物，对大量人工合成的有机物没有作用或是催化效率很低[9-13]。由于酶法合成与化学法合成相比具有一定的优越性，随着酶工程技术的发展，酶法合成头孢菌素类抗生素已日益受到重视[14]。本实验采用酶法对头孢氨苄合成工艺进行研究。
1 主要试剂及仪器
1.1 试剂：硫酸（沈阳市派尔精细化工制品厂）、二氯甲烷（石家庄和合化工化肥公司）、异丙醇（ 武汉市永发化工制造有限公司）、三乙胺（淄博赫业化工有限公司）、氢氧化钠（沈阳市派尔精细化工制品厂）、丙酮（ 东莞市盛龙化工有限公司）、四氢呋喃（深圳市富迪隆化工有限公司）、乙醇（ 东莞市盛龙化工有限公司）、盐酸（石家庄和合化工化肥公司）。
1.2 仪器：安捷伦1100高效液相色谱仪；安捷伦1100紫外检测器；Alliance柱温箱；奥豪斯Explorer专业型分析天平（奥豪斯仪器上海有限公司）；PHS-3C型酸度计（金坛市顺华仪器有限公司）；瑞士梅特勒-托利多MS精密天平（梅特勒-托利多中国公司）；Esquire 3000型LC-MS质谱仪；3L）（LM-C300超声波清洗器（武汉朗玛瑞特仪器有限公司）；IKA RV10 控制型 V 旋转蒸（广州仪科实验室技术有限公司）；M24×1.5型磁力搅拌器（威海景达化工机械有限公司）；Bruker AV.400型核磁共振仪；Histoon Lab S-5实验室超纯器（科尔顿（中国）有限公司）；BOC EDWARDS 真空泵（北京科宇翔贸易有限公司）；精密显微熔点测定仪（上海精科物理光学仪器厂）；HH-4数显电子恒温水浴锅（江苏省金坛市宏华仪器厂）。
1.3 色谱柱：奥泰公司 C18 色谱柱（284 mm×4.6mm，5μm）。
1.4 对照品：头孢氨苄 购自中国药品生物制品检定所。
2 分析方法
依据查阅文献及考查的结果，确定色谱条件如下。流动相：0.04mol/L磷酸溶液（用三乙胺调pH5.0）-乙腈（85：15）为流动相，检测波长：230nm，流速：1.0m·min-1。柱温：30℃。理论板数按头孢氨苄计算应不得低于2000。
3 实验
3.1 投酶量对合成收率的影响
对投酶量对合成收率的影响进行实验，分别反应液投酶量为1.2KU/L、1.4KU/L、1.6KU/L、1.8KU/L、2.0KU/L、2.2KU/L进行实验。液投酶量为1.2KU/L时收率为76.5%；液投酶量为1.4KU/L时收率为81.5%；液投酶量为1.6KU/L时收率为82.6%；液投酶量为1.8KU/L时收率为85.6%；液投酶量为2.0KU/L时收率为80.3%；液投酶量为2.2KU/L时收率为75.1%。实验结果表明液投酶量为1.8KU/L时收率最高。
3.2 PGM和7-ADCA投料比对合成收率的影响
在投酶量为1.8KU/L条件下，PGM：7-ADCA分别为0.8：1，，1：1，，1.2：1，，1.4：1，，1.6：1，1.8：1进行实验。PGM与7-ADCA比例为0.8：1时收率为75.1%；PGM与7-ADCA比例为1：1时收率为79.3%；PGM与7-ADCA比例为1.2：1时收率为85.3%；PGM与7-ADCA比例为1.4：1时收率为80.6%；PGM与7-ADCA比例为1.6：1时收率为78.6%；PGM与7-ADCA比例为1.8：1时收率为76.5%。实验结果表明PGM与7-ADCA比例为1.2：1时头孢氨苄摩尔收率最高。
3.3 酶催化合成反应温度合成收率的影响
在投酶量1.8KU/L，PGM与7-ADCA比例为1.2：1的条件下，合成反应温度分别为11摄氏度、13摄氏度、15摄氏度、17摄氏度和19摄氏度进行实验。反应温度分别为11摄氏度时收率为71.2%；反应温度分别为13摄氏度时收率为75.3%；反应温度分别为15摄氏度时收率为78.6%；反应温度分别为17摄氏度时收率为85.6%；反应温度分别为19摄氏度时收率为82.3%。实验结果表明反应温度分别为17摄氏度时头孢氨苄摩尔收率最高。
3.4 酶催化合成反应pH对合成收率的影响
在投酶量1.8KU/L，PGM与7-ADCA比例为1.2：1，合成反应温度分别为17摄氏度的条件下，分别采用PH值为6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7进行实验。PH值为6.2时收率为79.6%；PH值为6.3时收率为81.3%；PH值为6.4时收率为83.5%；PH值为6.5时收率为86.6%；PH值为6.6时收率为83.2%；PH值为6.7时收率为80.1%。实验结果表明PH值为6.5时头孢氨苄摩尔收率最高。
3.5 酶催化合成反应时间合成收率的影响
在投酶量1.8KU/L，PGM与7-ADCA比例为1.2：1，PH值为6.5，合成反应温度分别为17摄氏度的条件下，合成反应时间分别1.5小时、2.0小时、2.5小时、3.0小时、3.5小时进行实验。合成反应时间分别1.5小时收率为83.1%；合成反应时间分别2.0小时收率为85.1%；合成反应时间分别2.5小时收率为87.1%；合成反应时间分别3.0小时收率为85.3%；合成反应时间分别3.5小时收率为82.1%。实验结果表明合成反应时间分别2.5小时头孢氨苄摩尔收率最高。
4 结果
最佳工艺为投酶量1.8KU/L，PGM与7-ADCA比例为1.2：1，PH值为6.5，合成反应温度分别为17摄氏度的条件下，合成反应时间分别2.5小时。
参考文献
[1]张致平.β-内酰胺类抗生素研究的进展（Ⅰ）[J].中国抗生素杂志，2000（02）.
[2]崔福绵，朱丽钊，韩文珍，吴敏，王祯祥.固定化巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶酶促合成头孢氨苄的研究[J].微生物学报，1996（02）.
[3]吴伟波，王旭，王娜，吴起，林贤福.β-内酰胺类抗生素酶促合成新进展[J].有机化学，2006（03）.
[4]梅建凤，王普，王敏，杨根生.固定化酶催化合成头孢羟氨苄[J].浙江工业大学学报，2005（02）.
[5]石屹峰，虞星炬，袁权.反胶束体系中酶法合成头孢力新的动力学[J].化工学报，1997（02）.
[6]曾伟民，张基亮，李元敬，雷虹.酶法合成头孢菌素类抗生素的研究进展[J].黑龙江畜牧兽医，2010（23）.
[7]冯胜昔，梁世中.β-内酰胺抗生素的酶法合成研究进展[J].中国抗生素杂志，2004（11）.
[8]张莉，陶剑虹.半合成青霉素市场评析[J].药学进展，1998（01）.
[9]张启先.β-内酰胺类抗生素的酶法改造[J].抗生素，1983（03）.
[10]傅德才，狄蕊，李彬.頭孢菌素类抗生素的研究进展[J].河北师范大学学报，2006（06）.
[11]方长明，陈舒明，刘爱红.头孢氨苄的酶法制备工艺研究进展[J].中国医药工业杂志，2002（01）.
[12]叶树祥，徐成苗，王佳兵.固定化青霉素酰化酶合成头孢拉定的工艺研究[J].中国医药工业杂志，2007（09）.
[13]杨丰科，曹玮，李明.头孢菌素合成方法进展[J].青岛化工学院学报（自然科学版），2001（01）.
[14]冯胜昔，梁世中，龟山丰.反式头孢丙烯的酶法合成及其体外抗菌活性[J].中国抗生素杂志，2007（01）.
关键词：酶法；合成；研究
头孢羟氨苄为β-内酰胺类抗生素，对产青霉素酶和不产青霉素酶的金葡菌，凝固酶阴性葡萄球菌、肺炎链球菌、A组溶血性链球菌等大部分菌株具良好抗菌作用[1-5]。头孢羟氨苄主要用于泌尿道、胆道、及呼吸道等感染和敏感菌的所致的泌尿道、生殖道、呼吸道、皮肤软组织感染，也常用于中耳炎。酶法合成就酶催化反应与化学反应比较来看，酶反应的优点是专一性高，特别是对于立体异构；条件温和，常温常压，不需要耐高温高压的设备；催化速率高[6-8]。但酶一般来说较贵；由于酶的专一性高适用性小；由于一般的酶来自于生物，对大量人工合成的有机物没有作用或是催化效率很低[9-13]。由于酶法合成与化学法合成相比具有一定的优越性，随着酶工程技术的发展，酶法合成头孢菌素类抗生素已日益受到重视[14]。本实验采用酶法对头孢氨苄合成工艺进行研究。
1 主要试剂及仪器
1.1 试剂：硫酸（沈阳市派尔精细化工制品厂）、二氯甲烷（石家庄和合化工化肥公司）、异丙醇（ 武汉市永发化工制造有限公司）、三乙胺（淄博赫业化工有限公司）、氢氧化钠（沈阳市派尔精细化工制品厂）、丙酮（ 东莞市盛龙化工有限公司）、四氢呋喃（深圳市富迪隆化工有限公司）、乙醇（ 东莞市盛龙化工有限公司）、盐酸（石家庄和合化工化肥公司）。
1.2 仪器：安捷伦1100高效液相色谱仪；安捷伦1100紫外检测器；Alliance柱温箱；奥豪斯Explorer专业型分析天平（奥豪斯仪器上海有限公司）；PHS-3C型酸度计（金坛市顺华仪器有限公司）；瑞士梅特勒-托利多MS精密天平（梅特勒-托利多中国公司）；Esquire 3000型LC-MS质谱仪；3L）（LM-C300超声波清洗器（武汉朗玛瑞特仪器有限公司）；IKA RV10 控制型 V 旋转蒸（广州仪科实验室技术有限公司）；M24×1.5型磁力搅拌器（威海景达化工机械有限公司）；Bruker AV.400型核磁共振仪；Histoon Lab S-5实验室超纯器（科尔顿（中国）有限公司）；BOC EDWARDS 真空泵（北京科宇翔贸易有限公司）；精密显微熔点测定仪（上海精科物理光学仪器厂）；HH-4数显电子恒温水浴锅（江苏省金坛市宏华仪器厂）。
1.3 色谱柱：奥泰公司 C18 色谱柱（284 mm×4.6mm，5μm）。
1.4 对照品：头孢氨苄 购自中国药品生物制品检定所。
2 分析方法
依据查阅文献及考查的结果，确定色谱条件如下。流动相：0.04mol/L磷酸溶液（用三乙胺调pH5.0）-乙腈（85：15）为流动相，检测波长：230nm，流速：1.0m·min-1。柱温：30℃。理论板数按头孢氨苄计算应不得低于2000。
3 实验
3.1 投酶量对合成收率的影响
对投酶量对合成收率的影响进行实验，分别反应液投酶量为1.2KU/L、1.4KU/L、1.6KU/L、1.8KU/L、2.0KU/L、2.2KU/L进行实验。液投酶量为1.2KU/L时收率为76.5%；液投酶量为1.4KU/L时收率为81.5%；液投酶量为1.6KU/L时收率为82.6%；液投酶量为1.8KU/L时收率为85.6%；液投酶量为2.0KU/L时收率为80.3%；液投酶量为2.2KU/L时收率为75.1%。实验结果表明液投酶量为1.8KU/L时收率最高。
3.2 PGM和7-ADCA投料比对合成收率的影响
在投酶量为1.8KU/L条件下，PGM：7-ADCA分别为0.8：1，，1：1，，1.2：1，，1.4：1，，1.6：1，1.8：1进行实验。PGM与7-ADCA比例为0.8：1时收率为75.1%；PGM与7-ADCA比例为1：1时收率为79.3%；PGM与7-ADCA比例为1.2：1时收率为85.3%；PGM与7-ADCA比例为1.4：1时收率为80.6%；PGM与7-ADCA比例为1.6：1时收率为78.6%；PGM与7-ADCA比例为1.8：1时收率为76.5%。实验结果表明PGM与7-ADCA比例为1.2：1时头孢氨苄摩尔收率最高。
3.3 酶催化合成反应温度合成收率的影响
在投酶量1.8KU/L，PGM与7-ADCA比例为1.2：1的条件下，合成反应温度分别为11摄氏度、13摄氏度、15摄氏度、17摄氏度和19摄氏度进行实验。反应温度分别为11摄氏度时收率为71.2%；反应温度分别为13摄氏度时收率为75.3%；反应温度分别为15摄氏度时收率为78.6%；反应温度分别为17摄氏度时收率为85.6%；反应温度分别为19摄氏度时收率为82.3%。实验结果表明反应温度分别为17摄氏度时头孢氨苄摩尔收率最高。
3.4 酶催化合成反应pH对合成收率的影响
在投酶量1.8KU/L，PGM与7-ADCA比例为1.2：1，合成反应温度分别为17摄氏度的条件下，分别采用PH值为6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7进行实验。PH值为6.2时收率为79.6%；PH值为6.3时收率为81.3%；PH值为6.4时收率为83.5%；PH值为6.5时收率为86.6%；PH值为6.6时收率为83.2%；PH值为6.7时收率为80.1%。实验结果表明PH值为6.5时头孢氨苄摩尔收率最高。
3.5 酶催化合成反应时间合成收率的影响
在投酶量1.8KU/L，PGM与7-ADCA比例为1.2：1，PH值为6.5，合成反应温度分别为17摄氏度的条件下，合成反应时间分别1.5小时、2.0小时、2.5小时、3.0小时、3.5小时进行实验。合成反应时间分别1.5小时收率为83.1%；合成反应时间分别2.0小时收率为85.1%；合成反应时间分别2.5小时收率为87.1%；合成反应时间分别3.0小时收率为85.3%；合成反应时间分别3.5小时收率为82.1%。实验结果表明合成反应时间分别2.5小时头孢氨苄摩尔收率最高。
4 结果
最佳工艺为投酶量1.8KU/L，PGM与7-ADCA比例为1.2：1，PH值为6.5，合成反应温度分别为17摄氏度的条件下，合成反应时间分别2.5小时。
参考文献
[1]张致平.β-内酰胺类抗生素研究的进展（Ⅰ）[J].中国抗生素杂志，2000（02）.
[2]崔福绵，朱丽钊，韩文珍，吴敏，王祯祥.固定化巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶酶促合成头孢氨苄的研究[J].微生物学报，1996（02）.
[3]吴伟波，王旭，王娜，吴起，林贤福.β-内酰胺类抗生素酶促合成新进展[J].有机化学，2006（03）.
[4]梅建凤，王普，王敏，杨根生.固定化酶催化合成头孢羟氨苄[J].浙江工业大学学报，2005（02）.
[5]石屹峰，虞星炬，袁权.反胶束体系中酶法合成头孢力新的动力学[J].化工学报，1997（02）.
[6]曾伟民，张基亮，李元敬，雷虹.酶法合成头孢菌素类抗生素的研究进展[J].黑龙江畜牧兽医，2010（23）.
[7]冯胜昔，梁世中.β-内酰胺抗生素的酶法合成研究进展[J].中国抗生素杂志，2004（11）.
[8]张莉，陶剑虹.半合成青霉素市场评析[J].药学进展，1998（01）.
[9]张启先.β-内酰胺类抗生素的酶法改造[J].抗生素，1983（03）.
[10]傅德才，狄蕊，李彬.頭孢菌素类抗生素的研究进展[J].河北师范大学学报，2006（06）.
[11]方长明，陈舒明，刘爱红.头孢氨苄的酶法制备工艺研究进展[J].中国医药工业杂志，2002（01）.
[12]叶树祥，徐成苗，王佳兵.固定化青霉素酰化酶合成头孢拉定的工艺研究[J].中国医药工业杂志，2007（09）.
[13]杨丰科，曹玮，李明.头孢菌素合成方法进展[J].青岛化工学院学报（自然科学版），2001（01）.
[14]冯胜昔，梁世中，龟山丰.反式头孢丙烯的酶法合成及其体外抗菌活性[J].中国抗生素杂志，2007（01）.