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摘要：使用含裂解酶(来自Trichoderma harzianum)10mg/ml的0.8M NaCl（Ph5.8），28℃下，处理水稻立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)菌丝8小时，获得其原生质体。采用PEG介導的方法，将含有潮霉素B抗性标记的质粒pSM565转入水稻立枯丝核菌的原生质体，并在潮霉素B浓度为30μg/ml的选择性培养基上筛选转化子，获得了5-6个转化子/μg DNA的转化频率。随机挑选8个转化子，通过PCR方法检测到其中存在潮霉素抗性基因。
关键词：水稻立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)；原生质体转化；pSM565
中图分类号：Q37 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2010）-09-0046-2
由立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）引起的水稻纹枯病是世界性水稻三大病害之一[1]。立枯丝核菌的致病机理相当复杂，其致病能力是毒素，细胞壁降解酶和菌丝的机械压力这些因子共同作用的结果[2，5]。至于以哪种因子为主，以及各因子间如何相互协调作用还有待于进一步研究。本文构建了针对水稻立枯丝核菌的原生质体遗传转化体系，为从分子水平上研究该菌，进而揭示其致病机理奠定了坚实的基础。
1 材料与方法
1.1 菌株与培养基
水稻立枯丝核菌菌株Rh9由扬州农业大学分离保存。大肠杆菌E.coli DH10B用于载体分子的扩增和转化子中潮霉素B抗性基因的克隆。液体PDA培养基用于水稻立枯丝核菌菌丝的培养。固体PDA培养基用于水稻立枯丝核菌原生质体的再生和转化子的继代培养。液体TB3培养基用于原生质体的复苏。选择培养基（含30μg/ml 潮霉素和0.015%（W/V）琼脂的液体TB3培养基）用于转化子的筛选。
1.2 质粒DNA
用于转化的质粒载体pSM565（GenBank登录号为AY142483）由福建农林大学功能基因组学实验室保存。它带有潮霉素B磷酸转移酶基因（Hyg）和氨苄青霉素抗性基因（Amp）。
1.3 主要试剂
裂解酶(来自Trichoderma harzianum)购自Sigma公司。PEG3350购自Seebio Biotechnology公司。山梨糖醇（Sorbitol）购自Bio Lab公司。限制性内切酶购自New England Biolab（NEB）公司。
1.4 水稻立枯丝核菌原生质体的分离
裂解液：10%（W/V）裂解酶；0.8 mol/L NaCl（pH5.8）。SuTC溶液：20%（W/V）蔗糖，50 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，50mmol/L 无水CaCl2，抽滤灭菌。
挑取已生长4-6天的水稻立枯丝核菌Rh9菌丝块，捣碎后放入100ml液体PDA（包含50μg/ml amp）中，28℃下振荡培养2-3天。将培养好的菌丝用孔径为60μm的尼龙膜过滤后，再用0.8mol/L Nacl（pH5.8）冲洗1-2遍。将菌丝刮出，用镊子撕碎，放入约25ml裂解液中，28℃，80r/min，裂解8h。悬浮有原生质体的裂解液用灭过菌的尼龙膜过滤，再用0.8mol/L Nacl冲洗尼龙膜两次。将滤液于4℃，4500r/min，离心6min以收集原生质体，用1ml SuTC重悬原生质体，保存于-80℃。
1.5 水稻立枯丝核菌原生质体的转化
40%PEG3350溶液：含40%（W/V）PEG3350的SuTC溶液。
用SuTC将原生质体稀释至1×106个/ml。取200μl与1μg pSM565载体（图1）DNA混匀，室温下静置20min。加入1.25ml 40%PEG 3350混匀，室温下静置20min。加入5ml TB3液体培养基混匀，室温，80r/min振荡复苏过夜。离心收集原生质体，加入200μl SuTC，轻轻吸打至沉淀完全溶解。将溶液加入冷却至45-55℃的固体TB3（含30μg/ml hygromycin，50μg/ml Amp）中，混匀后，倒入培养皿中。28℃黑暗倒置培养5-6天。
1.6 转化子的PCR鉴定和测序验证
提取转化子的基因组DNA作为模板。根据pSM565中潮霉素抗性基因的5’和3’端序列设计一对特异引物，上游引物5’-GTGCTTTCAGCTTCGATG-3’，下游引物5’-AACCAAGCTCTGATAGAG-3’，以PCR法对转化子进行验证。反应条件为：95℃ 3分钟；95℃ 30秒，53℃ 30秒，72℃ 40秒，30个循环，72℃ 7分钟。PCR验证后，切胶回收目的条带，克隆后直接进行测序验证。
2 结果与分析
2.1 水稻立枯丝核菌原生质体的分离
由表1可见：只有用0.8M NaCl（pH5.8）做为渗透压稳定剂时，才可释放出水稻立枯丝核菌的原生质体。在28℃下，发现裂解8小时时，原生质体的得率最大。并且裂解酶质量浓度为15 mg/ml和20 mg/ml时的原生质体得率与10 mg/ml时相差不大（图2），因此采用质量浓度为10 mg/ml的裂解酶来制备水稻立枯丝核菌的原生质体。分离得到的原生质体呈透明的近椭圆形，中间可见1个或2个细胞核（图3），它们可在-80℃下保存6个月不丧失活性。
2.2 PEG介导的水稻立枯丝核菌原生质体遗传转化
使用本体系进行水稻立枯丝核菌转化时，转化频率为5-6个转化子/μg DNA。转化过程中发现水稻立枯丝核菌对潮霉素B很敏感，只需使用含30μg/ml潮霉素B的培养基即可胜任转化子的筛选任务。
2.3 转化子的PCR和测序验证
随机挑选8个转化子，提取其基因组DNA用于PCR验证。发现除野生型和2个转化子未能扩增出条带外，其余均可扩增出一条和载体一致的，大小为750bp预期的潮霉素抗性基因片段（图4）。将5、6、7、8泳道的条带回收、克隆并测序，测得的序列与潮霉素抗性基因序列完全匹配，表明潮霉素抗性基因已成功转入水稻立枯丝核菌的基因组中。
3 讨论
本试验在制备水稻立枯丝核菌原生质体的过程中发现由于在液体培养基中水稻立枯丝核菌的菌丝会聚集成球状生长，裂解前需先将它们撕碎，否则原生质体的得率不高。并且在离心收集原生质体时最好使用锥底管，否则原生质体容易悬浮在溶液中，影响收集。总之，不同真菌原生质体的制备受到多种因素的影响，需进行一系列相关实验以确定最佳分离条件。
在建立水稻立枯丝核菌原生质体遗传转化体系的过程中发现该菌对潮霉素B极为敏感，相对于深黄被孢霉菌（Mortierella isabellina）、稻瘟菌(Magnaporthe grisea)、赤霉菌（Gibberella fujlkurol）原生质体遗传转化体系中使用的潮霉素B的抗性筛选剂量，400μg/ml[6]，100μg/ml[7]，100μg/ml[8]，30μg/ml潮霉素B就可用于水稻立枯丝核菌转化子的筛选。
目前水稻立枯丝核菌的致病机理复杂难明。针对其原生质体的遗传转化体系的构建成功，将使人们能从分子水平上研究水稻立枯丝核菌致病相关基因的功能和致病过程。
参考文献
[1] Ou S.H.Rice Disease.2nd End.Commonwealth Agricultural Bureaux,Commonwealth Mycological Institute,Kew,England，1985.
[2] Betancourt O，Ciampi L.Contribution to the study and control of Rhizoctonia solani I:Extraction and bioassay of phenylacetic acid phytotoxicity produced in
vitro by R.solani AG-3[J].Fitopatologia，2000，35(2)：119-125.
[3] Xie QJ，Rush MC.In vitro selection of rice protoplast derived calli for
resistance to picolinic acid and phenylacetic acid[C].Proc 24th Rice Tech.Working Group，Little Rock，AK，1992.
[4] P.Vidhyasekaran,T.Ruby Ponmalar，R.Samiyappan，R. Velazhahan，R.Vimala，A.Ramanathan，V.Paranidharan and S.Muthukrishnan.Host-Specific Toxin Production by Rhizoctonia Solani，the Rice Sheath Blight Pathogen.Biochemistry and Cell Biology，1997，87(12)：1258-1263.
[5] 陈夕军,张洪，徐敬友，等.水稻纹枯病菌胞壁降解酶的产生及致病作用[J].江苏农业学报，2006，22（1）：24-28.
[6] 杨炜，黄大年，王金霞，等.以潮霉素抗性为选择标记的稻瘟病菌原生质体转化[J].遗传学报，1994，21（4）：305-312.
[7] 张学炜，王笑梅，李明春，等.以潮霉素B抗性为选择标记的深黄被孢霉原生质体转化[J].生物工程学报，2007，23（3）：462-466.
[8] 朱平，杨金玲，朱慧新，等.赤霉菌原生质体DNA转化[J].菌物系统,2000,19（2）：283-287.
基金项目：公益性农业科研专项资助（编号nyhyzx07-049）。
通讯作者：鲁国东。
关键词：水稻立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)；原生质体转化；pSM565
中图分类号：Q37 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2010）-09-0046-2
由立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）引起的水稻纹枯病是世界性水稻三大病害之一[1]。立枯丝核菌的致病机理相当复杂，其致病能力是毒素，细胞壁降解酶和菌丝的机械压力这些因子共同作用的结果[2，5]。至于以哪种因子为主，以及各因子间如何相互协调作用还有待于进一步研究。本文构建了针对水稻立枯丝核菌的原生质体遗传转化体系，为从分子水平上研究该菌，进而揭示其致病机理奠定了坚实的基础。
1 材料与方法
1.1 菌株与培养基
水稻立枯丝核菌菌株Rh9由扬州农业大学分离保存。大肠杆菌E.coli DH10B用于载体分子的扩增和转化子中潮霉素B抗性基因的克隆。液体PDA培养基用于水稻立枯丝核菌菌丝的培养。固体PDA培养基用于水稻立枯丝核菌原生质体的再生和转化子的继代培养。液体TB3培养基用于原生质体的复苏。选择培养基（含30μg/ml 潮霉素和0.015%（W/V）琼脂的液体TB3培养基）用于转化子的筛选。
1.2 质粒DNA
用于转化的质粒载体pSM565（GenBank登录号为AY142483）由福建农林大学功能基因组学实验室保存。它带有潮霉素B磷酸转移酶基因（Hyg）和氨苄青霉素抗性基因（Amp）。
1.3 主要试剂
裂解酶(来自Trichoderma harzianum)购自Sigma公司。PEG3350购自Seebio Biotechnology公司。山梨糖醇（Sorbitol）购自Bio Lab公司。限制性内切酶购自New England Biolab（NEB）公司。
1.4 水稻立枯丝核菌原生质体的分离
裂解液：10%（W/V）裂解酶；0.8 mol/L NaCl（pH5.8）。SuTC溶液：20%（W/V）蔗糖，50 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，50mmol/L 无水CaCl2，抽滤灭菌。
挑取已生长4-6天的水稻立枯丝核菌Rh9菌丝块，捣碎后放入100ml液体PDA（包含50μg/ml amp）中，28℃下振荡培养2-3天。将培养好的菌丝用孔径为60μm的尼龙膜过滤后，再用0.8mol/L Nacl（pH5.8）冲洗1-2遍。将菌丝刮出，用镊子撕碎，放入约25ml裂解液中，28℃，80r/min，裂解8h。悬浮有原生质体的裂解液用灭过菌的尼龙膜过滤，再用0.8mol/L Nacl冲洗尼龙膜两次。将滤液于4℃，4500r/min，离心6min以收集原生质体，用1ml SuTC重悬原生质体，保存于-80℃。
1.5 水稻立枯丝核菌原生质体的转化
40%PEG3350溶液：含40%（W/V）PEG3350的SuTC溶液。
用SuTC将原生质体稀释至1×106个/ml。取200μl与1μg pSM565载体（图1）DNA混匀，室温下静置20min。加入1.25ml 40%PEG 3350混匀，室温下静置20min。加入5ml TB3液体培养基混匀，室温，80r/min振荡复苏过夜。离心收集原生质体，加入200μl SuTC，轻轻吸打至沉淀完全溶解。将溶液加入冷却至45-55℃的固体TB3（含30μg/ml hygromycin，50μg/ml Amp）中，混匀后，倒入培养皿中。28℃黑暗倒置培养5-6天。
1.6 转化子的PCR鉴定和测序验证
提取转化子的基因组DNA作为模板。根据pSM565中潮霉素抗性基因的5’和3’端序列设计一对特异引物，上游引物5’-GTGCTTTCAGCTTCGATG-3’，下游引物5’-AACCAAGCTCTGATAGAG-3’，以PCR法对转化子进行验证。反应条件为：95℃ 3分钟；95℃ 30秒，53℃ 30秒，72℃ 40秒，30个循环，72℃ 7分钟。PCR验证后，切胶回收目的条带，克隆后直接进行测序验证。
2 结果与分析
2.1 水稻立枯丝核菌原生质体的分离
由表1可见：只有用0.8M NaCl（pH5.8）做为渗透压稳定剂时，才可释放出水稻立枯丝核菌的原生质体。在28℃下，发现裂解8小时时，原生质体的得率最大。并且裂解酶质量浓度为15 mg/ml和20 mg/ml时的原生质体得率与10 mg/ml时相差不大（图2），因此采用质量浓度为10 mg/ml的裂解酶来制备水稻立枯丝核菌的原生质体。分离得到的原生质体呈透明的近椭圆形，中间可见1个或2个细胞核（图3），它们可在-80℃下保存6个月不丧失活性。
2.2 PEG介导的水稻立枯丝核菌原生质体遗传转化
使用本体系进行水稻立枯丝核菌转化时，转化频率为5-6个转化子/μg DNA。转化过程中发现水稻立枯丝核菌对潮霉素B很敏感，只需使用含30μg/ml潮霉素B的培养基即可胜任转化子的筛选任务。
2.3 转化子的PCR和测序验证
随机挑选8个转化子，提取其基因组DNA用于PCR验证。发现除野生型和2个转化子未能扩增出条带外，其余均可扩增出一条和载体一致的，大小为750bp预期的潮霉素抗性基因片段（图4）。将5、6、7、8泳道的条带回收、克隆并测序，测得的序列与潮霉素抗性基因序列完全匹配，表明潮霉素抗性基因已成功转入水稻立枯丝核菌的基因组中。
3 讨论
本试验在制备水稻立枯丝核菌原生质体的过程中发现由于在液体培养基中水稻立枯丝核菌的菌丝会聚集成球状生长，裂解前需先将它们撕碎，否则原生质体的得率不高。并且在离心收集原生质体时最好使用锥底管，否则原生质体容易悬浮在溶液中，影响收集。总之，不同真菌原生质体的制备受到多种因素的影响，需进行一系列相关实验以确定最佳分离条件。
在建立水稻立枯丝核菌原生质体遗传转化体系的过程中发现该菌对潮霉素B极为敏感，相对于深黄被孢霉菌（Mortierella isabellina）、稻瘟菌(Magnaporthe grisea)、赤霉菌（Gibberella fujlkurol）原生质体遗传转化体系中使用的潮霉素B的抗性筛选剂量，400μg/ml[6]，100μg/ml[7]，100μg/ml[8]，30μg/ml潮霉素B就可用于水稻立枯丝核菌转化子的筛选。
目前水稻立枯丝核菌的致病机理复杂难明。针对其原生质体的遗传转化体系的构建成功，将使人们能从分子水平上研究水稻立枯丝核菌致病相关基因的功能和致病过程。
参考文献
[1] Ou S.H.Rice Disease.2nd End.Commonwealth Agricultural Bureaux,Commonwealth Mycological Institute,Kew,England，1985.
[2] Betancourt O，Ciampi L.Contribution to the study and control of Rhizoctonia solani I:Extraction and bioassay of phenylacetic acid phytotoxicity produced in
vitro by R.solani AG-3[J].Fitopatologia，2000，35(2)：119-125.
[3] Xie QJ，Rush MC.In vitro selection of rice protoplast derived calli for
resistance to picolinic acid and phenylacetic acid[C].Proc 24th Rice Tech.Working Group，Little Rock，AK，1992.
[4] P.Vidhyasekaran,T.Ruby Ponmalar，R.Samiyappan，R. Velazhahan，R.Vimala，A.Ramanathan，V.Paranidharan and S.Muthukrishnan.Host-Specific Toxin Production by Rhizoctonia Solani，the Rice Sheath Blight Pathogen.Biochemistry and Cell Biology，1997，87(12)：1258-1263.
[5] 陈夕军,张洪，徐敬友，等.水稻纹枯病菌胞壁降解酶的产生及致病作用[J].江苏农业学报，2006，22（1）：24-28.
[6] 杨炜，黄大年，王金霞，等.以潮霉素抗性为选择标记的稻瘟病菌原生质体转化[J].遗传学报，1994，21（4）：305-312.
[7] 张学炜，王笑梅，李明春，等.以潮霉素B抗性为选择标记的深黄被孢霉原生质体转化[J].生物工程学报，2007，23（3）：462-466.
[8] 朱平，杨金玲，朱慧新，等.赤霉菌原生质体DNA转化[J].菌物系统,2000,19（2）：283-287.
基金项目：公益性农业科研专项资助（编号nyhyzx07-049）。
通讯作者：鲁国东。