论文部分内容阅读
摘 要：为了深入研究鱼类snrpc基因的作用机制，通过分析斑马鱼snrpc的发育时序表达，来探讨snrpc基因在斑马鱼中的功能机理。从斑马鱼的胚胎中提取RNA，进行反转录、PCR、克隆等，得到snrpc基因在胚胎发育不同时期的表达水平。结果表明，在斑马鱼胚胎发育初期，snrpc表达量较高，随着胚胎的不断发育，snrpc的mRNA表达量有所下降，到后期表达量又上升。因此，snrpc表达量的变化可能预示着snrpc发挥功能的关键时期，对snrpc的克隆和表达分析，为后续进一步研究其相关功能奠定了基础。
关键词：斑马鱼；时序表达；snrpc
中图分类号 S965.299 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）08-14-02
Abstract：In order to further study the mechanism of snrpc in fish，we analysed the temporal expression of snrpc to explore the potential function of snrpc gene in zebrafish.In this study，the total RNA was extracted from zebrafish embryos，then cDNA was synthesized by reverse transcription. The snrpc gene was amplified successfully by PCR. The temporal expression pattems of ssnrpc among embryonic development were analyzed by RT-PCR. Results showed that the snrpc mRNA were mainly transcribed in the initial development of zebrafish embryos. With the embryonic development，the snrpc mRNA decreased.In the late stages of embryonic development，the mRNA rise again. Therefore，the changes may indicate that high mRNA level stages are the key periods. The cloning and expression characterization of snrpc laid the foundation for the further study of gene function.
Key words：Zebrafish；Temporal expression；Snrpc
snRNP蛋白在mRNA前体剪切中发挥着重要的功能[1-2]。本实验室在斑马鱼卵巢文库中扩增到一种snrpc基因。研究证明在两栖类的卵细胞中发现有SNRPC蛋白，但在鱼类中，仅在鲫鱼中有报道，但未作深入研究[3-5]，在鱼类中SNRPC蛋白如何发挥功能仍是未知数。在本研究中，通过分析斑马鱼snrpc的发育时序表达，来探讨其在斑马鱼发育过程中的功能机理，以期填补这方面研究的空白。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 斑马鱼的胚胎培养 斑马鱼（Danio rerio）置于（28±1）℃的水循环系统中进行养殖。
1.1.2 主要仪器设备 Sequi-Gen电泳仪系统，Bio-RabGONGSI公司；PCR仪，Bio-RabGONGSI公司；定量移液器，法国Glison公司；Bio-RabGONG-SI公司，凝胶成像系统，高速冷冻离心机；隔水式恒温培养箱，上海精宏实验公司；超净工作台；低温水浴锅；恒温水浴锅；恒温摇床，上海精宏实验公司。
1.1.3 主要试剂 PCR taq酶，TaKaRa公司；限制性内切酶，NEB公司；PCR纯化试剂盒、质粒提取试剂盒、酶切胶回收试剂盒，上海生工；T4连接酶购，Promega；KOD kit，TOYOBO。
1.2 实验方法
1.2.1 斑马鱼snrpc的克隆 （1）RNA的提取；（2）mRNA逆转录成cDNA；（3）PCR扩增目的基因snrpc。
将PCR的产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，将与预期一致的条带回收，连接、转化及阳性克隆鉴定。
1.2.2 mRNA表达水平检测
1.2.2.1 各个时期胚胎RNA的提取和cDNA的合成 和前面总RNA的提取和反转录合成第一链cDNA的方法一样，各个时期的胚胎各取50～100mg。
1.2.2.2 RT-PCR检测mRNA水平 RT-PCR中用到的引物如下：
2 结果与分析
2.1 snrpc基因克隆的结果及序列分析 用oligo dT引物逆转录合成mRNA的第一链cDNA。根据NCBI上预测的snrpc的全基因序列，设计引物，以第一链cDNA为模板PCR扩增snrpcc的ORF序列，得到与预期大小一致的条带（如图1）。由图1可知，在500bp与250bp之间的400bp处存在较亮条带与目的DNA条带大小相符，扩增片段正确。回收后，将该片段连接到pGEM-T vector上，转化到大肠杆菌JM109中，挑取单克隆，通过菌液PCR鉴定阳性克隆，测序结果显示与预期一致。snrpc的cDNA全长为398bp，包含3个部分，一个282bp的开放阅读框（ORF），编码94个氨基酸，长度为52bp的5′非编码区（5′-UTR，5′-untranslated region），长度为64bp的3′非编码区（3′-UTR，3′-untranslated region），有一个多聚腺苷酸加尾信号AATAA和一个多聚腺苷酸尾巴。 2.2 snrpc在胚胎发育不同时期的mRNA水平 为了进一步探究snrpc在斑马鱼胚胎发育各时期中所发挥的作用，本节中通过RT-PCR反应研究了在斑马鱼胚胎发育不同时期mRNA水平（如图2）。首先提取了不同发育时期胚胎的总RNA，通过mRNA逆转录合成cDNA，β-actin作为内参，以cDNA为模板，用β-actin引物进行PCR反应，确保提取的各时期RNA的逆转录效率大体一致，再以snrpc的引物进行PCR扩增，通过电泳检测，反应出胚胎发育各时期mRNA的表达量。
如图2，通过RT-PCR，检测到snrpc在斑马鱼早期不同胚胎发育时期的表达情况。结果显示，斑马鱼snrpc从受精后0h开始有表达，且表达量较高，在4hpf开始表达量降低，随后的6～9hpf表达量最低，基本检测不到。12hpf时短暂升高，之后的12～24hpf表达量再次降低，从36hpf之后表达量再次升高并维持在相对较高并稳定的水平。因此，斑马鱼snrpc为母源性基因，且在早期胚胎发育过程中呈现动态表达。
3 讨论
为了研究snrpc基因在斑马鱼中发挥的功能，克隆得到了snrpc基因的ORF序列。通过RT-PCR研究结果表明，snrpc mRNA在斑马鱼不同发育时期的表达情况则都呈现出一个动态变化的过程，在斑马鱼胚胎发育初期，snrpc表达量较高，可能参与了此阶段的mRNA前体的剪切加工。随着胚胎的不断发育，snrpc的mRNA表达量有所下降，受精后6～9h完全检测不到，这说明母源基因的耗尽。到后期表达量又上升，尤其是12h含量很高，说明snrpc很可能在这个时期发挥重要作用。同时这也说明对snrpc的表达调节是一个多层次、多方面的调控过程，确保snrpc在斑马鱼生长发育过程中的精确表达。
参考文献
[1]Sillekens P.T.，Beijer R.P.，Habets W.J.，et al.Human U1 snRNP-specific C protein：complete cDNA and protein sequence and identification of a multigene family in mammals[J].Nucl.Acids Res.，1988，16：8307-8321.
[2]Galliano M.，Minchiotti L.，Campagnoli M.，et al.Structural and biochemical characterization of a new type of lectin isolated from carp eggs[J].Biochem.J.，2003，376：433-440.
[3]Jantsch M.F.，Gall J.G..Assembly and localization of the U1-specific snRNP C protein in the amphibian oocyte[J].J.Cell Biol.，1992，119：1037-1046.
[4]Wang H.Y.，Zhou L.，Gui J.F.Identification and characterization of an oocyte-specific small nuclear ribonucleoprotein polypeptide C in gibel carp，Comp[J].Biochem.Phys.B，2007，146：47-52.
[5]王红莹，杜嫚.鲫鱼一种新型SNRPC基因的蛋白表达和抗体制备分析[J].河北农业科学，2010，14（12）：43-45.
（责编：张宏民）
关键词：斑马鱼；时序表达；snrpc
中图分类号 S965.299 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）08-14-02
Abstract：In order to further study the mechanism of snrpc in fish，we analysed the temporal expression of snrpc to explore the potential function of snrpc gene in zebrafish.In this study，the total RNA was extracted from zebrafish embryos，then cDNA was synthesized by reverse transcription. The snrpc gene was amplified successfully by PCR. The temporal expression pattems of ssnrpc among embryonic development were analyzed by RT-PCR. Results showed that the snrpc mRNA were mainly transcribed in the initial development of zebrafish embryos. With the embryonic development，the snrpc mRNA decreased.In the late stages of embryonic development，the mRNA rise again. Therefore，the changes may indicate that high mRNA level stages are the key periods. The cloning and expression characterization of snrpc laid the foundation for the further study of gene function.
Key words：Zebrafish；Temporal expression；Snrpc
snRNP蛋白在mRNA前体剪切中发挥着重要的功能[1-2]。本实验室在斑马鱼卵巢文库中扩增到一种snrpc基因。研究证明在两栖类的卵细胞中发现有SNRPC蛋白，但在鱼类中，仅在鲫鱼中有报道，但未作深入研究[3-5]，在鱼类中SNRPC蛋白如何发挥功能仍是未知数。在本研究中，通过分析斑马鱼snrpc的发育时序表达，来探讨其在斑马鱼发育过程中的功能机理，以期填补这方面研究的空白。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 斑马鱼的胚胎培养 斑马鱼（Danio rerio）置于（28±1）℃的水循环系统中进行养殖。
1.1.2 主要仪器设备 Sequi-Gen电泳仪系统，Bio-RabGONGSI公司；PCR仪，Bio-RabGONGSI公司；定量移液器，法国Glison公司；Bio-RabGONG-SI公司，凝胶成像系统，高速冷冻离心机；隔水式恒温培养箱，上海精宏实验公司；超净工作台；低温水浴锅；恒温水浴锅；恒温摇床，上海精宏实验公司。
1.1.3 主要试剂 PCR taq酶，TaKaRa公司；限制性内切酶，NEB公司；PCR纯化试剂盒、质粒提取试剂盒、酶切胶回收试剂盒，上海生工；T4连接酶购，Promega；KOD kit，TOYOBO。
1.2 实验方法
1.2.1 斑马鱼snrpc的克隆 （1）RNA的提取；（2）mRNA逆转录成cDNA；（3）PCR扩增目的基因snrpc。
将PCR的产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，将与预期一致的条带回收，连接、转化及阳性克隆鉴定。
1.2.2 mRNA表达水平检测
1.2.2.1 各个时期胚胎RNA的提取和cDNA的合成 和前面总RNA的提取和反转录合成第一链cDNA的方法一样，各个时期的胚胎各取50～100mg。
1.2.2.2 RT-PCR检测mRNA水平 RT-PCR中用到的引物如下：
2 结果与分析
2.1 snrpc基因克隆的结果及序列分析 用oligo dT引物逆转录合成mRNA的第一链cDNA。根据NCBI上预测的snrpc的全基因序列，设计引物，以第一链cDNA为模板PCR扩增snrpcc的ORF序列，得到与预期大小一致的条带（如图1）。由图1可知，在500bp与250bp之间的400bp处存在较亮条带与目的DNA条带大小相符，扩增片段正确。回收后，将该片段连接到pGEM-T vector上，转化到大肠杆菌JM109中，挑取单克隆，通过菌液PCR鉴定阳性克隆，测序结果显示与预期一致。snrpc的cDNA全长为398bp，包含3个部分，一个282bp的开放阅读框（ORF），编码94个氨基酸，长度为52bp的5′非编码区（5′-UTR，5′-untranslated region），长度为64bp的3′非编码区（3′-UTR，3′-untranslated region），有一个多聚腺苷酸加尾信号AATAA和一个多聚腺苷酸尾巴。 2.2 snrpc在胚胎发育不同时期的mRNA水平 为了进一步探究snrpc在斑马鱼胚胎发育各时期中所发挥的作用，本节中通过RT-PCR反应研究了在斑马鱼胚胎发育不同时期mRNA水平（如图2）。首先提取了不同发育时期胚胎的总RNA，通过mRNA逆转录合成cDNA，β-actin作为内参，以cDNA为模板，用β-actin引物进行PCR反应，确保提取的各时期RNA的逆转录效率大体一致，再以snrpc的引物进行PCR扩增，通过电泳检测，反应出胚胎发育各时期mRNA的表达量。
如图2，通过RT-PCR，检测到snrpc在斑马鱼早期不同胚胎发育时期的表达情况。结果显示，斑马鱼snrpc从受精后0h开始有表达，且表达量较高，在4hpf开始表达量降低，随后的6～9hpf表达量最低，基本检测不到。12hpf时短暂升高，之后的12～24hpf表达量再次降低，从36hpf之后表达量再次升高并维持在相对较高并稳定的水平。因此，斑马鱼snrpc为母源性基因，且在早期胚胎发育过程中呈现动态表达。
3 讨论
为了研究snrpc基因在斑马鱼中发挥的功能，克隆得到了snrpc基因的ORF序列。通过RT-PCR研究结果表明，snrpc mRNA在斑马鱼不同发育时期的表达情况则都呈现出一个动态变化的过程，在斑马鱼胚胎发育初期，snrpc表达量较高，可能参与了此阶段的mRNA前体的剪切加工。随着胚胎的不断发育，snrpc的mRNA表达量有所下降，受精后6～9h完全检测不到，这说明母源基因的耗尽。到后期表达量又上升，尤其是12h含量很高，说明snrpc很可能在这个时期发挥重要作用。同时这也说明对snrpc的表达调节是一个多层次、多方面的调控过程，确保snrpc在斑马鱼生长发育过程中的精确表达。
参考文献
[1]Sillekens P.T.，Beijer R.P.，Habets W.J.，et al.Human U1 snRNP-specific C protein：complete cDNA and protein sequence and identification of a multigene family in mammals[J].Nucl.Acids Res.，1988，16：8307-8321.
[2]Galliano M.，Minchiotti L.，Campagnoli M.，et al.Structural and biochemical characterization of a new type of lectin isolated from carp eggs[J].Biochem.J.，2003，376：433-440.
[3]Jantsch M.F.，Gall J.G..Assembly and localization of the U1-specific snRNP C protein in the amphibian oocyte[J].J.Cell Biol.，1992，119：1037-1046.
[4]Wang H.Y.，Zhou L.，Gui J.F.Identification and characterization of an oocyte-specific small nuclear ribonucleoprotein polypeptide C in gibel carp，Comp[J].Biochem.Phys.B，2007，146：47-52.
[5]王红莹，杜嫚.鲫鱼一种新型SNRPC基因的蛋白表达和抗体制备分析[J].河北农业科学，2010，14（12）：43-45.
（责编：张宏民）