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【摘要】 目的：观察重组人血管内皮抑制素（Endostar，恩度）对小鼠肝癌H22的抗血管生成作用，并对其机制进行初步探讨。方法：建立肝癌H22小鼠模型，共32只小鼠，随机分为A、B、C、D组，每组8只。在不同时间分别对各组给药。观察实验第18天小鼠肿瘤体积和微血管密度的情况。结果：实验第18天，接种肿瘤当天开始腹腔给药组（B组）与对照组（D组）肿瘤体积和微血管密度比较差异有统计学意义（P<0.05）。接种肿瘤前开始给药组（A组）和接种肿瘤后开始给药组（C组）与对照组（D组）肿瘤体积和微血管密度比较差异无统计学意义。结论：单独应用恩度（重组人血管内皮抑制素）有抗肿瘤作用，接种肿瘤时用药为最佳给药时机。
【关键词】 肝癌； 治疗； 恩度； 重组人血管内皮抑制素； 小鼠； H22肝癌细胞株
近代的理论研究发现肿瘤新生血管是肿瘤生长所必需的，实体肿瘤的生长和转移与血管生成密切相关，肿瘤有两种血管：即固有血管和因肿瘤细胞释放VEGF（血管内皮生长因子）生成的新生血管，后者是肿瘤生长的决定条件。重组人血管内皮抑制素注射液（Endostar，YH-16恩度）是我国学者自主创新研发的新型人血管内皮抑素，其联合化疗治疗NSCLC（非小细胞肺癌）有确切疗效，但对其他恶性肿瘤治疗的效果鲜有报道，从基础研究资料看恩度的作用都指向抗血管生成，所以借助于鼠模型观察恩度应用后肿瘤组织的生长情况，则能为下一步确定恩度的作用机制建立研究平台。
1 材料与方法
1.1 材料 肝癌H22瘤株，由中国药品制品鉴定所引进。4～5周龄昆明小鼠，雄性32只，平均体重19～22 g/只，由山西中医院研究所动物室提供。
动物室室温22～24 ℃，相对湿度40%～45%，日光灯12 h人工照明，专用鼠粮自由进食，洁净水自由饮用，动物实验室为清洁级。
1.2 方法 将冷冻保存在-80 ℃冰箱中的H22肝癌细胞复苏后，注射入昆明小鼠左腋下，7 d后，肿瘤生成明显。在无菌条件下取肿瘤，以培养液调整其中瘤细胞密度至1×107个细胞/ml，用注射器吸取肿瘤悬液0.2 ml注入32只4～5周龄的雄性昆明小鼠右腋下的皮下进行接种，建立动物模型。将32只小鼠按随机分组方法，分成A、B、C、D组，每组8只。A组开始给药时间为实验第1天。实验第5天所有小鼠接种肿瘤。恩度3 mg/kg注入腹腔，1次/d，直至小鼠被处死或小鼠死亡。实验第18天处死小鼠，留取肿瘤组织。A组于实验第1天（接种肿瘤前）开始给药。B组于实验第5天（接种肿瘤日）开始给药。C组于实验第9天（接种肿瘤日后第4 d）开始给药。D组对照组，只造模不给药。眼眶取血后处死小鼠，解剖出肿瘤称重。将全部标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋切片。免疫组化染色，抗CD34单克隆抗体标本。实验药物：恩度注射液（重组人内皮抑制素注射液）由山东先声麦得津生物制药有限公司生产，批号20100303。实验试剂：抗CD34单克隆抗体。
1.3 实验数据收集 小鼠肿瘤指标测定：将接种后的昆明小鼠喂养在清洁级动物室内，每日使用电子天平测量各小鼠体重。从实验第9天开始每日使用游标卡尺测量各小鼠右腋下肿瘤大小（单位为mm），计算肿瘤体积。肿瘤体积=长径×横径2/2。
1.4 染色结果判定及微血管密度的测定 CD34在光镜下将血管内皮细胞标染为棕黄色。采用Weidner等提出的方法对研究结果进行MVD量化分析。首先在40倍光镜视野下扫视整个切片寻找血管高密度集中的区域作为“热点”，这些区域通常位于肿瘤边缘区域的纤维组织中。然后在100倍光镜视野下计数微血管数目，各计数5个高倍视野，取其平均值作为该标本的微血管数。凡单个孤立的或多个紧密排列的内皮细胞团，只要与邻近肿瘤细胞及周围结缔组织成分分界清楚，不论有无血管腔，即可计数为1个微血管数。
1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0专用统计软件进行数据统计分析。计量资料以（x±s）表示，用单因素方差分析对实验数据结果进行方差齐性检验和统计分析，进一步采用LSD-t检验对数据进行多组间的两两比较分析与推断。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
实验第18天，接种肿瘤当天开始给药组（B组）与对照组（D组）肿瘤体积及微血管密度比较差异有统计学意义（P<0.05），接种肿瘤前开始给药组（A组）和接种肿瘤后开始给药组（C组）与对照组（D组）肿瘤体积及微血管密度比较差异无统计学意义。见表1。
3 讨论
恩度（重组人血管内皮抑制）是我国第1个上市的血管生成抑制剂类抗肿瘤药物（恩度），在针对非小细胞肺癌（NSCLC）联合化疗的临床试验中显示出良好的疗效[1]。也有文献报道，单独用恩度治疗仅3%有效，而此3%患者与其他肿瘤患者究竟是什么问题导致其治疗效果的显著差异，目前没有解决。
在研究实验中发现，如果抗肿瘤血管生成的治疗方案确实有效，除了表现为肿瘤体积较小，生存时间延长外，在肿瘤的组织切片中也表现为血管密度明显减少[2-3]。用CD34血管内皮细胞标记物检测肿瘤新生血管的微血管密度（microvessel density，MVD），标记肿瘤微血管内皮细胞计算微血管密度（MVD）可以间接定量肿瘤血管发生情况[4]。因此本研究以此为研究方向，选用抗小鼠肝癌H22细胞株移植的肿瘤模型，在肿瘤接种的不同时间采用恩度治疗，通过观察肿瘤体积和肿瘤组织的血管密度，评价不同给药时间恩度对肿瘤的作用，探索单用恩度疗效差的原因，研究分4个组，其中观察组3个，对照组1个，观察组恩度用量一致，其中A组于接种肿瘤前4 d采用恩度治疗，B组于接种肿瘤当日采用恩度治疗，C组与接种肿瘤后4 d用恩度，三个观察组中肿瘤体积和肿瘤组织血管密度与对照组比较，表1的研究结果表明：恩度治疗后从肿瘤体积和血管密度观察，恩度于肿瘤接种当天应用显示出恩度的治疗效果，与对照组相比二者均P<0.05，而恩度在肿瘤接种前和肿瘤接种后应用与对照组相比都不能使肿瘤血管密度和瘤体积发生变化（P>0.05）。基础研究认为：恩度作用于新生血管内皮的“爬行”，即肿瘤新生血管生成的“结果”阶段，而肿瘤的生长需经两个阶段，即无血管期和血管产生后的快速增殖期[5]，因此本研究的结论可以认为恩度与接种同时进行，有可能抑制了血管内皮的爬行而遏制了肿瘤血管的快速增殖，而其他两种情况就无此作用，显然恩度对肿瘤的作用是有限的，这种限制与肿瘤接种生长有直接关系，而对预防性用药和肿瘤已开始生长无关。 因此，恩度用药时机有高度选择性，作用于肿瘤生长的初期，其预防性用药和肿瘤生长后用药本研究未能看到确切的疗效。本实验研究恩度抗小鼠肝癌H22细胞株移植肿瘤的作用，选择接种肿瘤前、接种肿瘤当天、接种肿瘤之后3个给药时间。希望通过本实验研究发现恩度抗肿瘤的最佳给药时机。动态观察恩度应用后肿瘤生长情况，反映恩度与血管生成的相关性。结果表明在实验第18天，接种肿瘤当天开始给药组（B组）与对照组（D组）相比肿瘤体积和微血管密度比较差异有统计学意义（P<0.05），而接种肿瘤前开始给药组（A组）和接种肿瘤后开始给药组（C组）与对照组（D组）肿瘤体积和微血管密度没有统计学差异。说明腹腔注射恩度有抗肿瘤作用，与之前的报道相符；用药时机体现恩度抗肿瘤效果。本实验提示接种肿瘤当日开始给药能体现恩度抗肿瘤作用；而接种肿瘤前和肿瘤开始生长后给药不能体现恩度抗肿瘤效果。由此可见，恩度有可能只作用于新生血管，提前给药对肿瘤血管着床以及已形成的肿瘤血管生长均无效，肿瘤生长后给药对已形成的肿瘤血管生长也无效。肿瘤接种以后，接种和生长几乎同时，有可能接种以后刺激机体产生血管内皮生长因子，刺激肿瘤固有血管增生，恩度正是对此产生作用。接种肿瘤后开始给药无效是符合理论的，接种肿瘤前开始给药无效与理论不符，其机制有待进一步研究。为进一步研究恩度的抗肿瘤血管机制可对本实验所留取肿瘤标本，比较不同时间、不同组别小鼠肿瘤体积和微血管密度之间的差别。
综上所述，接种肿瘤当天开始腹腔注射恩度组（B组）小鼠肿瘤比单纯造模组（D组）小鼠肿瘤小、肿瘤血管密度低，接种肿瘤前、后开始给药组小鼠肿瘤体积与空白对照组小鼠肿瘤体积无统计学差异。接种肿瘤当天开始腹腔注射恩度有抗肿瘤作用，具体机制有待进一步研究。希望随着恩度抗肿瘤机制研究的进一步深入，恩度成为癌症治疗的必不可少的重要药物之一。
参考文献
[1] 王金万，孙燕，刘永煜，等.重组人血管内皮抑素联合NP方案治疗晚期NSCLC随机、双盲、对照、多中心Ⅲ期临床研究[J].中国肺癌杂志，2005，8（4）：283-290.
[2] Tan G H，Wei Y Q，Tian L，et al.Active immunotherapy of tumors with a recombinant xenogeneic endoglin as a model antigen[J].Eur J Immunol，2004，34（7）：2012-2021.
[3] Tan G H，Tian L，Wei Y Q，et al.Combination of low-dose cisplatin and recombinant xenogeneic endoglin as a accine induces synergistic antitumor activities[J].Int J Cancer，2004，112（4）：701-706.
[4] Wozney J M.Overview of bone morphogenetic proteins[J].Spine，2002，27（16 Suppl 1）：S2-S8.
[5] 谢传高，王兴鹏.血管生成与胰腺癌[J].世界华人消化杂志，2001，9（3）：338-341.
（收稿日期：2012-09-05） （本文编辑：李静）
【关键词】 肝癌； 治疗； 恩度； 重组人血管内皮抑制素； 小鼠； H22肝癌细胞株
近代的理论研究发现肿瘤新生血管是肿瘤生长所必需的，实体肿瘤的生长和转移与血管生成密切相关，肿瘤有两种血管：即固有血管和因肿瘤细胞释放VEGF（血管内皮生长因子）生成的新生血管，后者是肿瘤生长的决定条件。重组人血管内皮抑制素注射液（Endostar，YH-16恩度）是我国学者自主创新研发的新型人血管内皮抑素，其联合化疗治疗NSCLC（非小细胞肺癌）有确切疗效，但对其他恶性肿瘤治疗的效果鲜有报道，从基础研究资料看恩度的作用都指向抗血管生成，所以借助于鼠模型观察恩度应用后肿瘤组织的生长情况，则能为下一步确定恩度的作用机制建立研究平台。
1 材料与方法
1.1 材料 肝癌H22瘤株，由中国药品制品鉴定所引进。4～5周龄昆明小鼠，雄性32只，平均体重19～22 g/只，由山西中医院研究所动物室提供。
动物室室温22～24 ℃，相对湿度40%～45%，日光灯12 h人工照明，专用鼠粮自由进食，洁净水自由饮用，动物实验室为清洁级。
1.2 方法 将冷冻保存在-80 ℃冰箱中的H22肝癌细胞复苏后，注射入昆明小鼠左腋下，7 d后，肿瘤生成明显。在无菌条件下取肿瘤，以培养液调整其中瘤细胞密度至1×107个细胞/ml，用注射器吸取肿瘤悬液0.2 ml注入32只4～5周龄的雄性昆明小鼠右腋下的皮下进行接种，建立动物模型。将32只小鼠按随机分组方法，分成A、B、C、D组，每组8只。A组开始给药时间为实验第1天。实验第5天所有小鼠接种肿瘤。恩度3 mg/kg注入腹腔，1次/d，直至小鼠被处死或小鼠死亡。实验第18天处死小鼠，留取肿瘤组织。A组于实验第1天（接种肿瘤前）开始给药。B组于实验第5天（接种肿瘤日）开始给药。C组于实验第9天（接种肿瘤日后第4 d）开始给药。D组对照组，只造模不给药。眼眶取血后处死小鼠，解剖出肿瘤称重。将全部标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋切片。免疫组化染色，抗CD34单克隆抗体标本。实验药物：恩度注射液（重组人内皮抑制素注射液）由山东先声麦得津生物制药有限公司生产，批号20100303。实验试剂：抗CD34单克隆抗体。
1.3 实验数据收集 小鼠肿瘤指标测定：将接种后的昆明小鼠喂养在清洁级动物室内，每日使用电子天平测量各小鼠体重。从实验第9天开始每日使用游标卡尺测量各小鼠右腋下肿瘤大小（单位为mm），计算肿瘤体积。肿瘤体积=长径×横径2/2。
1.4 染色结果判定及微血管密度的测定 CD34在光镜下将血管内皮细胞标染为棕黄色。采用Weidner等提出的方法对研究结果进行MVD量化分析。首先在40倍光镜视野下扫视整个切片寻找血管高密度集中的区域作为“热点”，这些区域通常位于肿瘤边缘区域的纤维组织中。然后在100倍光镜视野下计数微血管数目，各计数5个高倍视野，取其平均值作为该标本的微血管数。凡单个孤立的或多个紧密排列的内皮细胞团，只要与邻近肿瘤细胞及周围结缔组织成分分界清楚，不论有无血管腔，即可计数为1个微血管数。
1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0专用统计软件进行数据统计分析。计量资料以（x±s）表示，用单因素方差分析对实验数据结果进行方差齐性检验和统计分析，进一步采用LSD-t检验对数据进行多组间的两两比较分析与推断。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
实验第18天，接种肿瘤当天开始给药组（B组）与对照组（D组）肿瘤体积及微血管密度比较差异有统计学意义（P<0.05），接种肿瘤前开始给药组（A组）和接种肿瘤后开始给药组（C组）与对照组（D组）肿瘤体积及微血管密度比较差异无统计学意义。见表1。
3 讨论
恩度（重组人血管内皮抑制）是我国第1个上市的血管生成抑制剂类抗肿瘤药物（恩度），在针对非小细胞肺癌（NSCLC）联合化疗的临床试验中显示出良好的疗效[1]。也有文献报道，单独用恩度治疗仅3%有效，而此3%患者与其他肿瘤患者究竟是什么问题导致其治疗效果的显著差异，目前没有解决。
在研究实验中发现，如果抗肿瘤血管生成的治疗方案确实有效，除了表现为肿瘤体积较小，生存时间延长外，在肿瘤的组织切片中也表现为血管密度明显减少[2-3]。用CD34血管内皮细胞标记物检测肿瘤新生血管的微血管密度（microvessel density，MVD），标记肿瘤微血管内皮细胞计算微血管密度（MVD）可以间接定量肿瘤血管发生情况[4]。因此本研究以此为研究方向，选用抗小鼠肝癌H22细胞株移植的肿瘤模型，在肿瘤接种的不同时间采用恩度治疗，通过观察肿瘤体积和肿瘤组织的血管密度，评价不同给药时间恩度对肿瘤的作用，探索单用恩度疗效差的原因，研究分4个组，其中观察组3个，对照组1个，观察组恩度用量一致，其中A组于接种肿瘤前4 d采用恩度治疗，B组于接种肿瘤当日采用恩度治疗，C组与接种肿瘤后4 d用恩度，三个观察组中肿瘤体积和肿瘤组织血管密度与对照组比较，表1的研究结果表明：恩度治疗后从肿瘤体积和血管密度观察，恩度于肿瘤接种当天应用显示出恩度的治疗效果，与对照组相比二者均P<0.05，而恩度在肿瘤接种前和肿瘤接种后应用与对照组相比都不能使肿瘤血管密度和瘤体积发生变化（P>0.05）。基础研究认为：恩度作用于新生血管内皮的“爬行”，即肿瘤新生血管生成的“结果”阶段，而肿瘤的生长需经两个阶段，即无血管期和血管产生后的快速增殖期[5]，因此本研究的结论可以认为恩度与接种同时进行，有可能抑制了血管内皮的爬行而遏制了肿瘤血管的快速增殖，而其他两种情况就无此作用，显然恩度对肿瘤的作用是有限的，这种限制与肿瘤接种生长有直接关系，而对预防性用药和肿瘤已开始生长无关。 因此，恩度用药时机有高度选择性，作用于肿瘤生长的初期，其预防性用药和肿瘤生长后用药本研究未能看到确切的疗效。本实验研究恩度抗小鼠肝癌H22细胞株移植肿瘤的作用，选择接种肿瘤前、接种肿瘤当天、接种肿瘤之后3个给药时间。希望通过本实验研究发现恩度抗肿瘤的最佳给药时机。动态观察恩度应用后肿瘤生长情况，反映恩度与血管生成的相关性。结果表明在实验第18天，接种肿瘤当天开始给药组（B组）与对照组（D组）相比肿瘤体积和微血管密度比较差异有统计学意义（P<0.05），而接种肿瘤前开始给药组（A组）和接种肿瘤后开始给药组（C组）与对照组（D组）肿瘤体积和微血管密度没有统计学差异。说明腹腔注射恩度有抗肿瘤作用，与之前的报道相符；用药时机体现恩度抗肿瘤效果。本实验提示接种肿瘤当日开始给药能体现恩度抗肿瘤作用；而接种肿瘤前和肿瘤开始生长后给药不能体现恩度抗肿瘤效果。由此可见，恩度有可能只作用于新生血管，提前给药对肿瘤血管着床以及已形成的肿瘤血管生长均无效，肿瘤生长后给药对已形成的肿瘤血管生长也无效。肿瘤接种以后，接种和生长几乎同时，有可能接种以后刺激机体产生血管内皮生长因子，刺激肿瘤固有血管增生，恩度正是对此产生作用。接种肿瘤后开始给药无效是符合理论的，接种肿瘤前开始给药无效与理论不符，其机制有待进一步研究。为进一步研究恩度的抗肿瘤血管机制可对本实验所留取肿瘤标本，比较不同时间、不同组别小鼠肿瘤体积和微血管密度之间的差别。
综上所述，接种肿瘤当天开始腹腔注射恩度组（B组）小鼠肿瘤比单纯造模组（D组）小鼠肿瘤小、肿瘤血管密度低，接种肿瘤前、后开始给药组小鼠肿瘤体积与空白对照组小鼠肿瘤体积无统计学差异。接种肿瘤当天开始腹腔注射恩度有抗肿瘤作用，具体机制有待进一步研究。希望随着恩度抗肿瘤机制研究的进一步深入，恩度成为癌症治疗的必不可少的重要药物之一。
参考文献
[1] 王金万，孙燕，刘永煜，等.重组人血管内皮抑素联合NP方案治疗晚期NSCLC随机、双盲、对照、多中心Ⅲ期临床研究[J].中国肺癌杂志，2005，8（4）：283-290.
[2] Tan G H，Wei Y Q，Tian L，et al.Active immunotherapy of tumors with a recombinant xenogeneic endoglin as a model antigen[J].Eur J Immunol，2004，34（7）：2012-2021.
[3] Tan G H，Tian L，Wei Y Q，et al.Combination of low-dose cisplatin and recombinant xenogeneic endoglin as a accine induces synergistic antitumor activities[J].Int J Cancer，2004，112（4）：701-706.
[4] Wozney J M.Overview of bone morphogenetic proteins[J].Spine，2002，27（16 Suppl 1）：S2-S8.
[5] 谢传高，王兴鹏.血管生成与胰腺癌[J].世界华人消化杂志，2001，9（3）：338-341.
（收稿日期：2012-09-05） （本文编辑：李静）