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【摘 要】 实验通过正交试验设计对中式油炸面食中丙烯酰胺提取的样品前处理过程中提取液、提取时间及提取温度等因素对提取结果的影响进行了探讨，以液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）为检测方法，以Agilent公司的ZORBAXSB-Aq（2.1×100mm，1.8μm）为色谱柱，以0.1%（v/v）的甲酸水溶液：甲醇（96∶4，v/v）为流动相，对经正交试验优化方法前处理后样品中的丙烯酰胺进行了分离和检测。结果显示：丙烯酰胺在0.01～50ng范围内呈良好的线性关系，相关系数R2=0.9961，变异系数为1.27%。样品中的丙烯酰胺加样回收率分别为90.1%±1.83%。丙烯酰胺的最低检测限是0.3ng/g。该方法样品前处理简单，灵敏度高，可在有关实验室推广应用。
【关键词】 丙烯酰胺；中式油炸面食；样品前处理；液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）
丙烯酰胺具有潜在的遗传性、神经毒性及致癌性[1]，通过动物实验，丙烯酰胺可以经过皮肤吸收引起皮炎和植物神经功能紊乱[2-4]。自2002年瑞典食品研究人员报道，在一些高温油炸、焙烤的淀粉类食品中检测出了较高含量的丙烯酰胺后。丙烯酰胺就成为了世界关注的热点。中国传统油炸面制品中含有致癌物质丙烯酰胺，减少油炸食品中的丙烯酰胺含量已成为研究的热点[5]。由于食物源性丙烯酰胺摄入对人体健康的评价与定性、定量分析方法的可靠性直接相关，丙烯酰胺（AA）含量分析方法的可行性也广受关注。而且目前国内外的研究主要针对丙烯酰胺的形成机理、检测方法、仪器条件优化、控制方法、原料选择等方面[6-12]。对于含油量高的中式油炸食品研究较少。鉴于高含油量油炸食品在检测的前处理中过程复杂、效率低等特点，所以样品提取的前处理也同样具有着重要的意义。
丙烯酰胺是一种高水溶性的α，β-不饱和羰基化合物，对于含油较多油炸面制品组成复杂，基质干扰多，提取过程中很容易发生乳化，去除油脂的干扰对测定样品的真实结果影响较大。本文采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）检测方法，对油炸食品中丙烯酰胺的除油方式进行优化，提取方法进行正交试验，确定一种快速准确的提取检测方法。
1、材料与方法
1.1材料与试剂
丙烯酰胺标准品、甲基丙烯酰胺标准品（≥99%）德国Dr公司；甲醇（色谱纯）美国J.T.Baker公司；甲酸（色谱纯）美国AlfaAesar公司；正丙醇、正己烷（色谱纯）天津科密欧化学试剂有限公司；实验室用水为超纯水；麻花、炸糕、油条购自市场。
1.2仪器与设备
1200超高压液相色谱仪、6410A三重四极杆质谱仪美国Agilent公司；ME215P电子天平德国Sartorius公司；PHB-4pH计上海雷磁仪器厂；HC-2517高速离心机科大创新股份有限公司；Milli-Q水纯化系统美国Millipore公司。
1.3方法
1.3.1色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Aq（2.1×100mm，1.8μm）；流动相：0.1%（v/v）的甲酸水溶液：甲醇（96∶4，v/v），等度洗脱；流速：0.15mL/min；室温；进样量：10μL。
1.3.2质谱条件
离子源：电喷雾离子源ESI（+）；毛细管电压4000V；雾化气流速8.0L/min；雾化气压力35psi；干燥气温度350℃；扫描方式：多反应监测模式（MRM）；母离子72、定量离子55、定量离子加速电压（Fragementor）100V、碰撞电压（collision energy CE）10V。
1.4相关计算公式
1.4.1变异系数的计算
标准偏差（n>5）：；相对标准偏差：
1.4.2回收率的计算
回收率=
1.5相关溶液的配置
0.1%甲酸溶液：取1ml甲酸溶液溶于100ml水中；
4%氯化钠水溶液：称取4gNaCl固体溶于100ml水中；
正丙醇：水（4：1）：取32ml正丙醇，溶于8ml水中；
CarrezⅠ试剂：称取15gK4[Fe（CN）6]·3H2O溶于100ml水中；
CarrezⅡ试剂：称取30gZnSO4·7H2O溶于100ml水中。
1.6标准曲线的绘制
称取2.5mg丙烯酰胺标准品，用水溶解并定容到25mL，作为母液，以母液为基础依次配制浓度为50ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、1ng/ml、0.5ng/ml、0.1ng/ml、0.05ng/ml、0.01ng/ml，依次进样。
经LC-MS/MS检测后，以丙烯酰胺标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制丙烯酰胺标准曲线图，回归方程为：Y=4498.5x+2891.9；相关系数：R2=0.9961。
1.7样品前处理
由于丙烯酰胺是极性小分子物质，在水中的溶解度极大，因此一般采用水或极性强的有机溶剂提取。油炸样品中的高脂肪含量对分析的影响，提取过程中很容易发生乳化，在样品的处理过程中应去除油脂。目前提取方法中对应的去油脂方式有先除脂再提取和先提取再除脂两种。本实验分别对样品进行先除脂实验和后除脂实验，采用正交试验对2种方法处理后的样品进行提取液、提取方法和提取温度考察，优化出除脂顺序对丙烯酰胺提取的影响[13.14]。
1.7.1先除油脂样品处理
称取1.000g左右磨碎均质样品于50mL离心管中，加入20mL正己烷，涡旋5min，弃去正己烷层（共重复去油三次）后用氮气吹干。加入提取液20mL，及CarrezⅠ试剂和CarrezⅡ试剂各5mL。提取一定时间后，10000r/min速率下离心15min[15]，取上清液中段约2.0mL过0.22μm水系微孔滤膜，滤液于小瓶中待测。 1.7.2后除油脂样品处理
称取1.000g左右磨碎均质样品于50mL离心管中，加入提取液20mL，及CarrezⅠ试剂和CarrezⅡ试剂各5mL。提取一定时间后，10000r/min速率下离心15min，用针管将清液（液体中部）转移至干净离心管中，加入10mL正己烷涡旋5min。将清液（液体中部）转移至干净离心管中，加入10mL正己烷，涡旋5min。再将离心管中液体下层水相转移，重复上述操作继续去油，共三次。取水相清液中段约2.0mL过0.22μm水系微孔滤膜，滤液于小瓶中待测。
1.8单因素试验
刘红河等人[16]采用先用正己烷除脂，蒸馏水振荡提取后，Carrez试剂净化提取样品；章宇等人[17]采用石油醚除酯，蒸馏水超声提取后，乙酸乙酯萃取后固相萃取柱净化；陆敏等人[18]直接用水在60℃磁力搅拌提取离心后，再用正己烷除酯，Carrez试剂净化；何秀丽等人[19]采用0.1%的甲酸溶液直接提取，冷冻后净化的方法提取样品。综合参考文献，固定其他因素，分别研究提取液种类、提取方式及提取温度对先除脂实验和后除脂实验样品中丙烯酰胺质量浓度的影响。
1.9正交试验
分别对1.7.1和1.7.2中样品，加入4%（v/v）氯化钠水溶液、0.1%（v/v）甲酸水溶液、正丙醇：水（4：1，v/v），采用涡旋、超声、先涡旋后超声的提取方式，在25℃、45℃、65℃提取温度下处理样品，以丙烯酰胺质量浓度为指标，确定提取效率的高低。
2、结果与分析
2.1色谱条件的优化
2.1.1色谱柱的选择
由于丙烯酰胺属于强极性化合物，在ZORBAX EcLipLusC18（2.1×100mm，1.8μm）柱上保留较弱，在实验过程中出现了出峰早，严重拖尾的情况。之后为了优化峰形，所以又采用了ZORBAX SB-Aq（2.1×100mm，1.8μm）柱，拖尾现象明显得到改善，并且可以较好的分离丙烯酰胺。与王浩等人[20]的实验结果相近。
2.1.2流动相流速的选择
主要讨论了流速1mL/min、1.5mL/min及2mL/min时的情况，发现：1mL/min时拖尾现象较严重；1.5mL/min时效果最佳；2mL/min及>2mL/min时出峰过小。最后选取1.5mL/min为最终流动相流速。
最终确定色谱条件为：色谱柱：AgiLent ZORBAX SB-Aq（2.1×100mm，1.8μm）；流动相：0.1%（v/v）的甲酸水溶液：甲醇（96∶4，v/v），等度洗脱；流速：0.15mL/min；室温；进样量：10μL。
2.2样品前处理条件的选择
2.2.1提取液的选择
选择比较三种提取液：1.美国食品药品监督管理局（FDA）推荐使用的0.1%（v/v）甲酸溶液。由于丙烯酰胺具有弱碱性，所以提取丙烯酰胺在酸性溶液中更加稳定。2.一些研究人员使用4%（v/v）氯化钠水溶液，认为可以达到破乳的目的。在实验过程中也发现了同样的问题，使用氯化钠溶液可以避免样品前处理过程中出现乳化现象。3.有研究人员用纯水提取丙烯酰胺后，上清液过0.45μm滤膜。考虑到使用涡旋、超声的提取方式可能导致含有丙烯酰胺的溶液被脂肪粒包裹。于是优化后采用正丙醇：水（4：1，v/v）作为提取液。正丙醇能够同时提取包埋在脂肪微粒中的丙烯酰胺，使提取更完全，并且便于浓缩作进一步处理。
2.2.2提取方式的选择
目前主要以涡旋、超声来提取丙烯酰胺。Magnus Jezussek等人[21]用超声提取，但是在实验过程中出现了乳化现象，加入Carrez试剂沉降蛋白，效果不明显。后使用涡旋方式提取
2.2.3提取温度的选择
目前有冷提取和热提取两种，冷提取可以避免丙烯酰胺在加热的条件下与溶液中其他物质发生反应或分解，热提取可以增加让提取更加充分。在因素选择上设置了三个温度，最终在常温下提取样品中的较为完全
2.3方法学验证
2.3.1精密度及稳定性实验
以0.01、1、50ng/mL的标准溶液分别代表低、中、高浓度，各浓度溶液分别连续进样6次，计算得到3个浓度测定的相对标准偏差（RSD）分别为1.73%、0.92%和1.16%，50ng/mL丙烯酰胺标准品6次进样结果见图2。取有代表性受试样品2份，按节1.7.2进行样品前处理后于1d内的3个不同时段进行进样分析；同时，分3d连续测定，取平均值并计算RSD值。两种代表性样品中，油条的日内和日间差RSD分别为2.11%和3.62%，麻花的日内和日间差RSD分别为1.23%和2.33%。
图2 稳定性实验：50ng/mL丙烯酰胺标准品6次进样结果复合图
Fig.2 Stability experiment： 50 ng/mL acryl amide standard composite figure 6 sample results
2.3.2最低检测限和加标回收率实验
取低浓度丙烯酰胺标准溶液，用超纯水逐级稀释并进样测定，以3倍信噪比为基准，测得该条件下丙烯酰胺的最低检测限（LOD）为0.01ng/mL。按照优化后前处理方法对样品进行前处理以LC-MS/MS发测其丙烯酰胺含量，然后在单一样品中再分别加入10、100、500μg/kg的丙烯酰胺标准溶液，按照同样的前处理方法处理后，每个加标样品测定4次，并计算样品加标回收率。见表3
表3 代表性样品中丙烯酰胺测定的加标回收率
Table 3 Spiked recovery of acryl amide in representative samples 加标水平
（μg/kg） 未加标的丙烯酰胺含量（μg/kg） 加标后的丙烯酰胺含量（μg/kg） 回收率
（%）
10
100 279.9
279.9 264.7
342.3 91.3±1.5
90.1±2.1
500 279.9 693.3 88.9±1.9
2.4单因素试验结果
2.4.1提取液种类对丙烯酰胺质量分数的影响
选择不同提取液（4%（v/v）氯化钠水溶液、0.1%（v/v）甲酸水溶液、正丙醇：水（4：1，v/v）），涡旋5min为提取方法，提取温度25℃，考察不同提取液对丙烯酰胺提取量的影响。结果表明，当提取液为0.1%（v/v）甲酸水溶液时，检测出的丙烯酰胺含量最大。见表4
表4 固定提取方式、提取温度时不同提取液丙烯酰胺的提取结果
Table 4 Fixed temperature and extraction method to extract different extract of acryl amide’s extraction results
提取液种类 4%（v/v）氯化钠水溶液 0.1%（v/v）甲酸水溶液 正丙醇：水（4：1，v/v）
峰面积A 716 3171 2737
峰个数 3 2 2
2.4.2提取方式对丙烯酰胺质量分数的影响
以提取液为0.1%（v/v）甲酸水溶液，提取温度25℃，考察不同提取方式（涡旋5min、超声20min、涡旋5min后超声20min）对丙烯酰胺提取量的影响。结果表明，当提取方式为时，检测出的丙烯酰胺含量最大。见表5
表5 固定提取液、提取温度时不同提取方式丙烯酰胺的提取结果
Table 5 Fixed extract extraction and temperatures at different
extraction methods of acryl amide’s extraction results
提取方式 涡旋5min 超声20min 涡旋5min后超声20min
峰面积A 3184 1966 2859
峰个数 2 2 2
2.4.3提取温度对丙烯酰胺质量分数的影响
以提取液为0.1%（v/v）甲酸水溶液，提取方式为，采用不同的提取温度（25、45、65℃）进行提取，考察不同提取温度对丙烯酰胺提取量的影响。结果表明，当提取方式为时，检测出的丙烯酰胺含量最大。见表6
表6 固定提取方式、提取液时不同提取温度丙烯酰胺的提取结果
Table 6 Fixed extract extraction and extraction way
to extract the acryl amide of various extraction temperatures
提取温度/℃ 25 45 65
峰面积A 2699 1902 1733
峰个数 2 2 2
2.5正交实验结果与分析
根据单因素试验结果，以样品丙烯酰胺提取量为评价指标，选取提取液种类、提取方式、提取温度为考察因素，各取3个水平，分别就前除脂及后除脂方法进行L9（34）正交试验设计，以确定样品丙烯酰胺提取前处理最优条件。
2.5.1丙烯酰胺提取前除脂方法
优化结果分析：从表6中的极差（R）结果可以直观看出，影响因素对丙烯酰胺提取量的影响程度的大小分别为提取液种类（A）>提取方式（B）>提取温度（C），结合各因素的K值，得出最佳样品丙烯酰胺提取前处理条件为提取液为0.1%（v/v）甲酸水溶液，提取方式涡旋提取5min，提取温度45℃。方差分析结果：通过表8可以看出3个因素的影响均具有显著性差异，F比值越大，对实验结果的影响也就越大，即A>B>C，与直观分析结果一致。
2.5.2丙烯酰胺提取后除脂方法
总结：比较丙烯酰胺提取前除脂及后除脂的正交实验结果——考虑到提取温度因素的显著性及实验操作的简便性，选择提取温度25℃而非45℃；由于前除脂需要进行氮吹较为繁琐及对丙烯酰胺的提取效率略低，选择后除脂的处理方法。
最终确定提取液0.1%（v/v）甲酸水溶液，提取方式涡旋提取5min，提取温度25℃为优化后的前处理条件。
2.6不同中式油炸面食中丙烯酰胺含量的测定
在上述实验的基础上，选取三种传统中国油炸面食（麻花、油条、炸糕），并且每种面食选取四种口味不同、选取样品部分不同及销售点不同的样品，保证样品的普遍性。样品经过优化后的前处理方法提取丙烯酰胺，并采用液相色谱-质谱联用法（LC-MS/MS）检测各产品中丙烯酰胺的含量。不同样品中丙烯酰胺经 LC-MS/MS测定含量在1.475～187.575μg/kg之间，其水分含量越大，则丙烯酰胺的含量越高。
3、结论
本实验采用液相色谱- 串联质谱法（LC-MS/MS）为检测方法，通过单因素实验选择出因素与水平设计正交试验，并最终使用最优前处理方法对当地中式油炸面点食品进行丙烯酰胺的含量测定。使用ZORBAX SB-Aq（2.1×100mm，1.8μm）为色谱柱，可以很好的分离丙烯酰胺。用0.1%（v/v）甲酸溶液作提取液，在常温25℃下涡旋5min提取。选用先提取后去油的顺序。经研究发现，前处理因素中对实验结果影响最大的是提取液的选择，其次是去油顺序的选择，最后是提取方式以及温度的选择。
参考文献：
[1] WTO.Guidelines for drinking water quality[R].2nd edition，Geneva：WTO.1993.73
[2]王慧兰，聂兴田，李凤玲.丙烯酰胺中毒原因的分析[J].中华劳动卫生职业病杂志.1997，15（5）：265-267
[3]邓海，焦小云，何凤生.丙烯酰胺和环氧丙酰胺的神经毒性研究[J].中华预防医学杂志.1997，31（4）：202-205
[4]陈婉蓉，端礼荣，陈志坚等.丙烯酰胺对大鼠胚胎神经细胞分化的影响[J]职业与健康.2001，17（12）：21-22
[5] ROSEN J， HELLENASK E. Analys is of acry lamide in cooked foods by liquid chromatography tandem mass spectrometry[ J] . Analys，t 2002， 127（ 7）：880- 882.
[6]钟南京，陆启玉等.油炸及焙烤食品中丙烯酰胺含量影响因素的研究进展[J].河南工业大学学报（自然科学版），2006，27（3）88-90.
【关键词】 丙烯酰胺；中式油炸面食；样品前处理；液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）
丙烯酰胺具有潜在的遗传性、神经毒性及致癌性[1]，通过动物实验，丙烯酰胺可以经过皮肤吸收引起皮炎和植物神经功能紊乱[2-4]。自2002年瑞典食品研究人员报道，在一些高温油炸、焙烤的淀粉类食品中检测出了较高含量的丙烯酰胺后。丙烯酰胺就成为了世界关注的热点。中国传统油炸面制品中含有致癌物质丙烯酰胺，减少油炸食品中的丙烯酰胺含量已成为研究的热点[5]。由于食物源性丙烯酰胺摄入对人体健康的评价与定性、定量分析方法的可靠性直接相关，丙烯酰胺（AA）含量分析方法的可行性也广受关注。而且目前国内外的研究主要针对丙烯酰胺的形成机理、检测方法、仪器条件优化、控制方法、原料选择等方面[6-12]。对于含油量高的中式油炸食品研究较少。鉴于高含油量油炸食品在检测的前处理中过程复杂、效率低等特点，所以样品提取的前处理也同样具有着重要的意义。
丙烯酰胺是一种高水溶性的α，β-不饱和羰基化合物，对于含油较多油炸面制品组成复杂，基质干扰多，提取过程中很容易发生乳化，去除油脂的干扰对测定样品的真实结果影响较大。本文采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）检测方法，对油炸食品中丙烯酰胺的除油方式进行优化，提取方法进行正交试验，确定一种快速准确的提取检测方法。
1、材料与方法
1.1材料与试剂
丙烯酰胺标准品、甲基丙烯酰胺标准品（≥99%）德国Dr公司；甲醇（色谱纯）美国J.T.Baker公司；甲酸（色谱纯）美国AlfaAesar公司；正丙醇、正己烷（色谱纯）天津科密欧化学试剂有限公司；实验室用水为超纯水；麻花、炸糕、油条购自市场。
1.2仪器与设备
1200超高压液相色谱仪、6410A三重四极杆质谱仪美国Agilent公司；ME215P电子天平德国Sartorius公司；PHB-4pH计上海雷磁仪器厂；HC-2517高速离心机科大创新股份有限公司；Milli-Q水纯化系统美国Millipore公司。
1.3方法
1.3.1色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Aq（2.1×100mm，1.8μm）；流动相：0.1%（v/v）的甲酸水溶液：甲醇（96∶4，v/v），等度洗脱；流速：0.15mL/min；室温；进样量：10μL。
1.3.2质谱条件
离子源：电喷雾离子源ESI（+）；毛细管电压4000V；雾化气流速8.0L/min；雾化气压力35psi；干燥气温度350℃；扫描方式：多反应监测模式（MRM）；母离子72、定量离子55、定量离子加速电压（Fragementor）100V、碰撞电压（collision energy CE）10V。
1.4相关计算公式
1.4.1变异系数的计算
标准偏差（n>5）：；相对标准偏差：
1.4.2回收率的计算
回收率=
1.5相关溶液的配置
0.1%甲酸溶液：取1ml甲酸溶液溶于100ml水中；
4%氯化钠水溶液：称取4gNaCl固体溶于100ml水中；
正丙醇：水（4：1）：取32ml正丙醇，溶于8ml水中；
CarrezⅠ试剂：称取15gK4[Fe（CN）6]·3H2O溶于100ml水中；
CarrezⅡ试剂：称取30gZnSO4·7H2O溶于100ml水中。
1.6标准曲线的绘制
称取2.5mg丙烯酰胺标准品，用水溶解并定容到25mL，作为母液，以母液为基础依次配制浓度为50ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、1ng/ml、0.5ng/ml、0.1ng/ml、0.05ng/ml、0.01ng/ml，依次进样。
经LC-MS/MS检测后，以丙烯酰胺标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制丙烯酰胺标准曲线图，回归方程为：Y=4498.5x+2891.9；相关系数：R2=0.9961。
1.7样品前处理
由于丙烯酰胺是极性小分子物质，在水中的溶解度极大，因此一般采用水或极性强的有机溶剂提取。油炸样品中的高脂肪含量对分析的影响，提取过程中很容易发生乳化，在样品的处理过程中应去除油脂。目前提取方法中对应的去油脂方式有先除脂再提取和先提取再除脂两种。本实验分别对样品进行先除脂实验和后除脂实验，采用正交试验对2种方法处理后的样品进行提取液、提取方法和提取温度考察，优化出除脂顺序对丙烯酰胺提取的影响[13.14]。
1.7.1先除油脂样品处理
称取1.000g左右磨碎均质样品于50mL离心管中，加入20mL正己烷，涡旋5min，弃去正己烷层（共重复去油三次）后用氮气吹干。加入提取液20mL，及CarrezⅠ试剂和CarrezⅡ试剂各5mL。提取一定时间后，10000r/min速率下离心15min[15]，取上清液中段约2.0mL过0.22μm水系微孔滤膜，滤液于小瓶中待测。 1.7.2后除油脂样品处理
称取1.000g左右磨碎均质样品于50mL离心管中，加入提取液20mL，及CarrezⅠ试剂和CarrezⅡ试剂各5mL。提取一定时间后，10000r/min速率下离心15min，用针管将清液（液体中部）转移至干净离心管中，加入10mL正己烷涡旋5min。将清液（液体中部）转移至干净离心管中，加入10mL正己烷，涡旋5min。再将离心管中液体下层水相转移，重复上述操作继续去油，共三次。取水相清液中段约2.0mL过0.22μm水系微孔滤膜，滤液于小瓶中待测。
1.8单因素试验
刘红河等人[16]采用先用正己烷除脂，蒸馏水振荡提取后，Carrez试剂净化提取样品；章宇等人[17]采用石油醚除酯，蒸馏水超声提取后，乙酸乙酯萃取后固相萃取柱净化；陆敏等人[18]直接用水在60℃磁力搅拌提取离心后，再用正己烷除酯，Carrez试剂净化；何秀丽等人[19]采用0.1%的甲酸溶液直接提取，冷冻后净化的方法提取样品。综合参考文献，固定其他因素，分别研究提取液种类、提取方式及提取温度对先除脂实验和后除脂实验样品中丙烯酰胺质量浓度的影响。
1.9正交试验
分别对1.7.1和1.7.2中样品，加入4%（v/v）氯化钠水溶液、0.1%（v/v）甲酸水溶液、正丙醇：水（4：1，v/v），采用涡旋、超声、先涡旋后超声的提取方式，在25℃、45℃、65℃提取温度下处理样品，以丙烯酰胺质量浓度为指标，确定提取效率的高低。
2、结果与分析
2.1色谱条件的优化
2.1.1色谱柱的选择
由于丙烯酰胺属于强极性化合物，在ZORBAX EcLipLusC18（2.1×100mm，1.8μm）柱上保留较弱，在实验过程中出现了出峰早，严重拖尾的情况。之后为了优化峰形，所以又采用了ZORBAX SB-Aq（2.1×100mm，1.8μm）柱，拖尾现象明显得到改善，并且可以较好的分离丙烯酰胺。与王浩等人[20]的实验结果相近。
2.1.2流动相流速的选择
主要讨论了流速1mL/min、1.5mL/min及2mL/min时的情况，发现：1mL/min时拖尾现象较严重；1.5mL/min时效果最佳；2mL/min及>2mL/min时出峰过小。最后选取1.5mL/min为最终流动相流速。
最终确定色谱条件为：色谱柱：AgiLent ZORBAX SB-Aq（2.1×100mm，1.8μm）；流动相：0.1%（v/v）的甲酸水溶液：甲醇（96∶4，v/v），等度洗脱；流速：0.15mL/min；室温；进样量：10μL。
2.2样品前处理条件的选择
2.2.1提取液的选择
选择比较三种提取液：1.美国食品药品监督管理局（FDA）推荐使用的0.1%（v/v）甲酸溶液。由于丙烯酰胺具有弱碱性，所以提取丙烯酰胺在酸性溶液中更加稳定。2.一些研究人员使用4%（v/v）氯化钠水溶液，认为可以达到破乳的目的。在实验过程中也发现了同样的问题，使用氯化钠溶液可以避免样品前处理过程中出现乳化现象。3.有研究人员用纯水提取丙烯酰胺后，上清液过0.45μm滤膜。考虑到使用涡旋、超声的提取方式可能导致含有丙烯酰胺的溶液被脂肪粒包裹。于是优化后采用正丙醇：水（4：1，v/v）作为提取液。正丙醇能够同时提取包埋在脂肪微粒中的丙烯酰胺，使提取更完全，并且便于浓缩作进一步处理。
2.2.2提取方式的选择
目前主要以涡旋、超声来提取丙烯酰胺。Magnus Jezussek等人[21]用超声提取，但是在实验过程中出现了乳化现象，加入Carrez试剂沉降蛋白，效果不明显。后使用涡旋方式提取
2.2.3提取温度的选择
目前有冷提取和热提取两种，冷提取可以避免丙烯酰胺在加热的条件下与溶液中其他物质发生反应或分解，热提取可以增加让提取更加充分。在因素选择上设置了三个温度，最终在常温下提取样品中的较为完全
2.3方法学验证
2.3.1精密度及稳定性实验
以0.01、1、50ng/mL的标准溶液分别代表低、中、高浓度，各浓度溶液分别连续进样6次，计算得到3个浓度测定的相对标准偏差（RSD）分别为1.73%、0.92%和1.16%，50ng/mL丙烯酰胺标准品6次进样结果见图2。取有代表性受试样品2份，按节1.7.2进行样品前处理后于1d内的3个不同时段进行进样分析；同时，分3d连续测定，取平均值并计算RSD值。两种代表性样品中，油条的日内和日间差RSD分别为2.11%和3.62%，麻花的日内和日间差RSD分别为1.23%和2.33%。
图2 稳定性实验：50ng/mL丙烯酰胺标准品6次进样结果复合图
Fig.2 Stability experiment： 50 ng/mL acryl amide standard composite figure 6 sample results
2.3.2最低检测限和加标回收率实验
取低浓度丙烯酰胺标准溶液，用超纯水逐级稀释并进样测定，以3倍信噪比为基准，测得该条件下丙烯酰胺的最低检测限（LOD）为0.01ng/mL。按照优化后前处理方法对样品进行前处理以LC-MS/MS发测其丙烯酰胺含量，然后在单一样品中再分别加入10、100、500μg/kg的丙烯酰胺标准溶液，按照同样的前处理方法处理后，每个加标样品测定4次，并计算样品加标回收率。见表3
表3 代表性样品中丙烯酰胺测定的加标回收率
Table 3 Spiked recovery of acryl amide in representative samples 加标水平
（μg/kg） 未加标的丙烯酰胺含量（μg/kg） 加标后的丙烯酰胺含量（μg/kg） 回收率
（%）
10
100 279.9
279.9 264.7
342.3 91.3±1.5
90.1±2.1
500 279.9 693.3 88.9±1.9
2.4单因素试验结果
2.4.1提取液种类对丙烯酰胺质量分数的影响
选择不同提取液（4%（v/v）氯化钠水溶液、0.1%（v/v）甲酸水溶液、正丙醇：水（4：1，v/v）），涡旋5min为提取方法，提取温度25℃，考察不同提取液对丙烯酰胺提取量的影响。结果表明，当提取液为0.1%（v/v）甲酸水溶液时，检测出的丙烯酰胺含量最大。见表4
表4 固定提取方式、提取温度时不同提取液丙烯酰胺的提取结果
Table 4 Fixed temperature and extraction method to extract different extract of acryl amide’s extraction results
提取液种类 4%（v/v）氯化钠水溶液 0.1%（v/v）甲酸水溶液 正丙醇：水（4：1，v/v）
峰面积A 716 3171 2737
峰个数 3 2 2
2.4.2提取方式对丙烯酰胺质量分数的影响
以提取液为0.1%（v/v）甲酸水溶液，提取温度25℃，考察不同提取方式（涡旋5min、超声20min、涡旋5min后超声20min）对丙烯酰胺提取量的影响。结果表明，当提取方式为时，检测出的丙烯酰胺含量最大。见表5
表5 固定提取液、提取温度时不同提取方式丙烯酰胺的提取结果
Table 5 Fixed extract extraction and temperatures at different
extraction methods of acryl amide’s extraction results
提取方式 涡旋5min 超声20min 涡旋5min后超声20min
峰面积A 3184 1966 2859
峰个数 2 2 2
2.4.3提取温度对丙烯酰胺质量分数的影响
以提取液为0.1%（v/v）甲酸水溶液，提取方式为，采用不同的提取温度（25、45、65℃）进行提取，考察不同提取温度对丙烯酰胺提取量的影响。结果表明，当提取方式为时，检测出的丙烯酰胺含量最大。见表6
表6 固定提取方式、提取液时不同提取温度丙烯酰胺的提取结果
Table 6 Fixed extract extraction and extraction way
to extract the acryl amide of various extraction temperatures
提取温度/℃ 25 45 65
峰面积A 2699 1902 1733
峰个数 2 2 2
2.5正交实验结果与分析
根据单因素试验结果，以样品丙烯酰胺提取量为评价指标，选取提取液种类、提取方式、提取温度为考察因素，各取3个水平，分别就前除脂及后除脂方法进行L9（34）正交试验设计，以确定样品丙烯酰胺提取前处理最优条件。
2.5.1丙烯酰胺提取前除脂方法
优化结果分析：从表6中的极差（R）结果可以直观看出，影响因素对丙烯酰胺提取量的影响程度的大小分别为提取液种类（A）>提取方式（B）>提取温度（C），结合各因素的K值，得出最佳样品丙烯酰胺提取前处理条件为提取液为0.1%（v/v）甲酸水溶液，提取方式涡旋提取5min，提取温度45℃。方差分析结果：通过表8可以看出3个因素的影响均具有显著性差异，F比值越大，对实验结果的影响也就越大，即A>B>C，与直观分析结果一致。
2.5.2丙烯酰胺提取后除脂方法
总结：比较丙烯酰胺提取前除脂及后除脂的正交实验结果——考虑到提取温度因素的显著性及实验操作的简便性，选择提取温度25℃而非45℃；由于前除脂需要进行氮吹较为繁琐及对丙烯酰胺的提取效率略低，选择后除脂的处理方法。
最终确定提取液0.1%（v/v）甲酸水溶液，提取方式涡旋提取5min，提取温度25℃为优化后的前处理条件。
2.6不同中式油炸面食中丙烯酰胺含量的测定
在上述实验的基础上，选取三种传统中国油炸面食（麻花、油条、炸糕），并且每种面食选取四种口味不同、选取样品部分不同及销售点不同的样品，保证样品的普遍性。样品经过优化后的前处理方法提取丙烯酰胺，并采用液相色谱-质谱联用法（LC-MS/MS）检测各产品中丙烯酰胺的含量。不同样品中丙烯酰胺经 LC-MS/MS测定含量在1.475～187.575μg/kg之间，其水分含量越大，则丙烯酰胺的含量越高。
3、结论
本实验采用液相色谱- 串联质谱法（LC-MS/MS）为检测方法，通过单因素实验选择出因素与水平设计正交试验，并最终使用最优前处理方法对当地中式油炸面点食品进行丙烯酰胺的含量测定。使用ZORBAX SB-Aq（2.1×100mm，1.8μm）为色谱柱，可以很好的分离丙烯酰胺。用0.1%（v/v）甲酸溶液作提取液，在常温25℃下涡旋5min提取。选用先提取后去油的顺序。经研究发现，前处理因素中对实验结果影响最大的是提取液的选择，其次是去油顺序的选择，最后是提取方式以及温度的选择。
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