论文部分内容阅读
[摘 要]目的 考察注射用头孢替安的细菌内毒素检查方法。方法 按《中国药典》2005年版二部收载的细菌内毒素检查方法进行试验。结果 实验表明当头孢替安稀释成2mg/ml时，对鲎试剂的凝集反应无抑制作用。结论 可以用细菌内毒素检查法替代家兔热原法来注射用头孢替安的质量。
[关键词]注射用头孢替安；鲎试剂；细菌内毒素
中图分类号：R9 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2013）12-0231-01
细菌内毒素检查是静脉、鞘内给药药物以及放射性药物等质量检查的一个重要方面。以前，细菌内毒素检查用家兔热原法进行，自从1980年《美国药典》第20版收载了细菌内毒素实验以来，《英国药典》《欧洲药典》《日本药局方》《中国药典》等相继收载了该方法。1995年《美国药典》第23版已收载了471种药品进行细菌内毒素检查，而《中国药典》1995年版也收载了12种药品进行细菌内毒素检查[1]，2000版更收载有47种药品利用此方法进行热原检查。细菌内毒素检查法已逐渐代替家兔热原检查法，显示出其在检查热原方面的重要性。
注射用盐酸头孢替安（Cefotiam Hydrochloride for Injection， CHI）为抗生素类药，主要用于敏感的各种葡萄球菌、各种链球菌（肠球菌除外）、肺炎双球菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌、克雷白氏菌属、枸橼酸杆菌、变形杆菌属、普通变形杆菌等引起的感染。临床上最大用量为每次2g，静脉滴注。现行药品质量标准采用家兔法检查其热原[2]
1 方法、机理及影响因素
1.1 应用的方法目前，美国药品食品管理局（FDA）承认3种鲎试剂检测细菌内毒素含量的方法，即凝胶（gelclot）法、生色（chromogenic）法和动态浊度（keniticturbidimetry）法[3]。近年来较新的方法有水箭电泳免疫法（测残余蛋白）、酶联免疫吸附法（测残余酶）。后者所需鲎试剂仅相当于凝胶法的1/100，且灵敏度更高，抗干扰能力更好。《中国药典》1995年版只采用凝胶法。凝胶法是将等体积的供试品溶液和新配制的鲎试剂（TAL）溶液在试管中混匀，一般各0.1 ml，（37±1）℃反应（60±2）min。如果被检测的溶液不含干扰凝集反应的因素，且其含有内素素浓度等于或大于所用鲎试剂的灵敏度（λ）时，就会在试管中显示阳性反应，即形成凝胶；否则呈阴性反应，即呈澄明溶液或轻度混浊，视内毒素的浓度而定[1]。该反应极其灵敏，凝胶形成速率与内毒素浓度成正比，并受温度、反应物中Ca2+/Mg2+离子浓度和pH等因素的影响[3]。同样，《中国药典》2000年版也只采用凝胶法。
2 实验材料
CHI，规格0.5g，批号B20070112、B20070113、B20070301（为市售品、同一公司生产，经热原检查均符合规定）。细菌内毒素工作标准品，批号2007-5，效价100EU/支（中国药品生物制品检定所）。鲎试剂（TAL）批号：0602160（湛江博康海洋生物有限公司，规格：0.1ml/支）；批号0705250（湛江安度斯生物有限公司，0.1ml/支）。灵敏度（λ）均为0.25EU/ml，且经灵敏度复核均符合规定。细菌内毒素检查用水（BET水）批号2006.12，内毒素含量≤0.015EU/ml（中国药品生物物品检定所）。
3 方法與结果
3.1 CHI的细菌内毒素限值（L）的计算[4]
根据公式L=K/M计算， K（人体致热阈值）为5.0EU/kg，CHI每小时最大用量为2g，人均体重按60kg计，即每小时剂量M为33mg/kg，因此，CHI的细菌内毒素限值L为：K/M=0.15EU/mg；CHI药品质量标准的热原检查方法为：1ml中含CHI 40mg的注射用水溶液，每1kg家兔注射1ml，即每小时剂量M为40mg/kg，则根据公式L=K/M计算，CHI的细菌内毒素限值L为：K/M=0.125EU/mg，结合二种计算方法结果，确定其细菌内毒素限值为：L=0.125EU/mg。
3.2 供试液的制备
取本品1瓶，加BET水5ml将样品稀释成每1ml中含CHI为100mg的溶液，作为供试液。
3.3 供试液最大有效稀释倍数（MVD）的确定
按照公式MVD=L/λ计算，由于供试液的浓度为100/ml，则其相对应的内毒素限度L为12.5EU/ml。λ为市售TAL的常用最高灵敏度0.031EU/ml，计算得供试液的最大有效稀释倍数为400倍。实验时按市售常用鲎试剂灵敏度0.03～0.5EU/ml，则供试液的稀释倍数可取25、50、100、200、400倍。
3.4 干扰试验
3.4.1 干扰试验预试验
为考察供试品本身对TAL与细菌内毒素凝胶反应可能存在的干扰，将CHI先用BET水稀释成100mg/ml的溶液，再做25、50、100、200、400倍稀释，用此溶液作为溶剂溶解并稀释内毒素，使每个稀释度中内毒素的含量均为2λ，用灵敏度为0.2EU/ml的二批TAL分别进行试验，同时作阳性和阴性对照，结果见表1。从表1的结果看，CHI对鲎试剂的凝胶化反应存在一定的干扰作用，但当供试液作50倍稀释（即CHI浓度为2mg/ml）时，供试液对鲎试剂的反应基本无干扰。
3.4.2 干扰试验
分别用BET水及上述稀释倍数为50倍（对应于λ为0.25EU/ml的TAL）的供试品溶液作溶剂，将细菌内毒素工作标准品稀释成0.5、0.25、0.125、0.06EU/ml的稀释液，与λ为0.25EU/ml的TAL进行反应，结果见表2。从表2的结果看，TAL在BET水和3个批号供试品中的λ值均在0.5～2.0 范围内，符合中国药典对细菌内毒素检查有效性的规定[4]。
3.5 供试品的细菌内毒素检查
CHI的L值为0.125EU/mg，根据干扰试验结果，将CHI先用BET水稀释成100mg/ml的溶液，再做50倍稀释，与λ为0.25EU/ml的TAL分别进行试验。
4 小结
实验结果表明，CHI对鲎试剂的凝胶化反应存在一定的干扰作用，但这种干扰作用随着供试品的稀释（当样品稀释成2mg/ml时）可有效消除。用细菌内毒素检查法来替代家兔热原法对CHI进行质量控制是可行的，其细菌内毒素的限值为0.125EU/mg，具体的检查的方法为：用BET水将CHI稀释成100mg/ml的溶液，再做50倍或更大倍数的稀释，选用λ为0.25EU/ml或灵敏度更高的TAL来进行试验。
5 应用前景
细菌内毒素检查法作为一种新技术载入药典，成为一种法定的药检方法，反映了药典标准水平、药检技术水平的提高，标志着一个国家制药工业水平及药品质量的提高。随着历史的发展，必将有更多国家的药典收载细菌内毒素检查法。它具有方法多样化、自动化、微量化的特点。细菌内毒素检查法所具有的优点表明它比家免热原检查法更适应现代制药工业的发展。它可以应用于药检，也可以用于药品生产质量控制、临床诊断及其它领域。该法用于药品成品的检查，属于一种事前控制的质控手段，对提高药品质量，避免造成药品成批报废有重要意义；在临床上可作为快速诊断革兰氏阴性细菌感染的疾病的一种辅助方法，但不能区分病原体。其它在食品卫生、环境保护、电子工业（如超纯水的检查）等领域也涉及到细菌内毒素检查的应用。
[关键词]注射用头孢替安；鲎试剂；细菌内毒素
中图分类号：R9 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2013）12-0231-01
细菌内毒素检查是静脉、鞘内给药药物以及放射性药物等质量检查的一个重要方面。以前，细菌内毒素检查用家兔热原法进行，自从1980年《美国药典》第20版收载了细菌内毒素实验以来，《英国药典》《欧洲药典》《日本药局方》《中国药典》等相继收载了该方法。1995年《美国药典》第23版已收载了471种药品进行细菌内毒素检查，而《中国药典》1995年版也收载了12种药品进行细菌内毒素检查[1]，2000版更收载有47种药品利用此方法进行热原检查。细菌内毒素检查法已逐渐代替家兔热原检查法，显示出其在检查热原方面的重要性。
注射用盐酸头孢替安（Cefotiam Hydrochloride for Injection， CHI）为抗生素类药，主要用于敏感的各种葡萄球菌、各种链球菌（肠球菌除外）、肺炎双球菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌、克雷白氏菌属、枸橼酸杆菌、变形杆菌属、普通变形杆菌等引起的感染。临床上最大用量为每次2g，静脉滴注。现行药品质量标准采用家兔法检查其热原[2]
1 方法、机理及影响因素
1.1 应用的方法目前，美国药品食品管理局（FDA）承认3种鲎试剂检测细菌内毒素含量的方法，即凝胶（gelclot）法、生色（chromogenic）法和动态浊度（keniticturbidimetry）法[3]。近年来较新的方法有水箭电泳免疫法（测残余蛋白）、酶联免疫吸附法（测残余酶）。后者所需鲎试剂仅相当于凝胶法的1/100，且灵敏度更高，抗干扰能力更好。《中国药典》1995年版只采用凝胶法。凝胶法是将等体积的供试品溶液和新配制的鲎试剂（TAL）溶液在试管中混匀，一般各0.1 ml，（37±1）℃反应（60±2）min。如果被检测的溶液不含干扰凝集反应的因素，且其含有内素素浓度等于或大于所用鲎试剂的灵敏度（λ）时，就会在试管中显示阳性反应，即形成凝胶；否则呈阴性反应，即呈澄明溶液或轻度混浊，视内毒素的浓度而定[1]。该反应极其灵敏，凝胶形成速率与内毒素浓度成正比，并受温度、反应物中Ca2+/Mg2+离子浓度和pH等因素的影响[3]。同样，《中国药典》2000年版也只采用凝胶法。
2 实验材料
CHI，规格0.5g，批号B20070112、B20070113、B20070301（为市售品、同一公司生产，经热原检查均符合规定）。细菌内毒素工作标准品，批号2007-5，效价100EU/支（中国药品生物制品检定所）。鲎试剂（TAL）批号：0602160（湛江博康海洋生物有限公司，规格：0.1ml/支）；批号0705250（湛江安度斯生物有限公司，0.1ml/支）。灵敏度（λ）均为0.25EU/ml，且经灵敏度复核均符合规定。细菌内毒素检查用水（BET水）批号2006.12，内毒素含量≤0.015EU/ml（中国药品生物物品检定所）。
3 方法與结果
3.1 CHI的细菌内毒素限值（L）的计算[4]
根据公式L=K/M计算， K（人体致热阈值）为5.0EU/kg，CHI每小时最大用量为2g，人均体重按60kg计，即每小时剂量M为33mg/kg，因此，CHI的细菌内毒素限值L为：K/M=0.15EU/mg；CHI药品质量标准的热原检查方法为：1ml中含CHI 40mg的注射用水溶液，每1kg家兔注射1ml，即每小时剂量M为40mg/kg，则根据公式L=K/M计算，CHI的细菌内毒素限值L为：K/M=0.125EU/mg，结合二种计算方法结果，确定其细菌内毒素限值为：L=0.125EU/mg。
3.2 供试液的制备
取本品1瓶，加BET水5ml将样品稀释成每1ml中含CHI为100mg的溶液，作为供试液。
3.3 供试液最大有效稀释倍数（MVD）的确定
按照公式MVD=L/λ计算，由于供试液的浓度为100/ml，则其相对应的内毒素限度L为12.5EU/ml。λ为市售TAL的常用最高灵敏度0.031EU/ml，计算得供试液的最大有效稀释倍数为400倍。实验时按市售常用鲎试剂灵敏度0.03～0.5EU/ml，则供试液的稀释倍数可取25、50、100、200、400倍。
3.4 干扰试验
3.4.1 干扰试验预试验
为考察供试品本身对TAL与细菌内毒素凝胶反应可能存在的干扰，将CHI先用BET水稀释成100mg/ml的溶液，再做25、50、100、200、400倍稀释，用此溶液作为溶剂溶解并稀释内毒素，使每个稀释度中内毒素的含量均为2λ，用灵敏度为0.2EU/ml的二批TAL分别进行试验，同时作阳性和阴性对照，结果见表1。从表1的结果看，CHI对鲎试剂的凝胶化反应存在一定的干扰作用，但当供试液作50倍稀释（即CHI浓度为2mg/ml）时，供试液对鲎试剂的反应基本无干扰。
3.4.2 干扰试验
分别用BET水及上述稀释倍数为50倍（对应于λ为0.25EU/ml的TAL）的供试品溶液作溶剂，将细菌内毒素工作标准品稀释成0.5、0.25、0.125、0.06EU/ml的稀释液，与λ为0.25EU/ml的TAL进行反应，结果见表2。从表2的结果看，TAL在BET水和3个批号供试品中的λ值均在0.5～2.0 范围内，符合中国药典对细菌内毒素检查有效性的规定[4]。
3.5 供试品的细菌内毒素检查
CHI的L值为0.125EU/mg，根据干扰试验结果，将CHI先用BET水稀释成100mg/ml的溶液，再做50倍稀释，与λ为0.25EU/ml的TAL分别进行试验。
4 小结
实验结果表明，CHI对鲎试剂的凝胶化反应存在一定的干扰作用，但这种干扰作用随着供试品的稀释（当样品稀释成2mg/ml时）可有效消除。用细菌内毒素检查法来替代家兔热原法对CHI进行质量控制是可行的，其细菌内毒素的限值为0.125EU/mg，具体的检查的方法为：用BET水将CHI稀释成100mg/ml的溶液，再做50倍或更大倍数的稀释，选用λ为0.25EU/ml或灵敏度更高的TAL来进行试验。
5 应用前景
细菌内毒素检查法作为一种新技术载入药典，成为一种法定的药检方法，反映了药典标准水平、药检技术水平的提高，标志着一个国家制药工业水平及药品质量的提高。随着历史的发展，必将有更多国家的药典收载细菌内毒素检查法。它具有方法多样化、自动化、微量化的特点。细菌内毒素检查法所具有的优点表明它比家免热原检查法更适应现代制药工业的发展。它可以应用于药检，也可以用于药品生产质量控制、临床诊断及其它领域。该法用于药品成品的检查，属于一种事前控制的质控手段，对提高药品质量，避免造成药品成批报废有重要意义；在临床上可作为快速诊断革兰氏阴性细菌感染的疾病的一种辅助方法，但不能区分病原体。其它在食品卫生、环境保护、电子工业（如超纯水的检查）等领域也涉及到细菌内毒素检查的应用。