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摘要：目的：探讨裸花紫珠对结核分枝杆菌H37Rv标准菌株及临床分离株的抑菌活性。方法：采用直接作用法让受试菌与不同浓度的裸花紫珠溶液与作用24小时，然后将受试菌接种于中性改良罗氏培养基[1]培养4周，观察、记录、分析试验现象。结果：裸花紫珠对结核分枝杆菌H37Rv标准菌株和临床分离株最低抑菌浓度MIC50为4.0mg/ml，MIC90为8.0mg/ml，MIC范围为4.0-8.0mg/ml。结论：裸花紫珠对结核分枝杆菌H37Rv菌株及临床分离株有较好的体外抑菌活性。
关键词：裸花紫珠，结核分枝杆菌，抑菌
基金资助：湖南省卫生厅科研基金课题（B2012-119）
结核病仍是我国重大传染性疾病之一，其中最常见的是肺结核病，它是由结核分枝杆菌通过空气传播所致。近年来，临床上大量应用多种可有效控制结核病的药物，如链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺等，但容易产生耐药性，特别是多重耐药性和广泛耐药性结核分枝杆菌的出现，给结核病的治疗带来了严重困难[2]。落花紫珠为马鞭草科紫珠属植物，又名紫珠，主产于我国海南。落花紫珠具有解毒、抗菌消炎、收敛止血、散瘀消肿等多重药理活性，临床上主要与其它中草药配伍，用于治疗化脓性炎症、急性传染性肝炎、呼吸道及消化道出血等疾病及肺结核咯血等症[3-6]。国内已经有将裸花紫珠和西药联用治疗肺结核的临床应用[7]，但对结核分枝杆菌的抑菌效果尚未有文献报道。自2013年2月至2014年2月期间，本课题探讨落花紫珠在体外的抑制作用，测定该药物对结核分枝杆菌的MIC。
1 材料与方法
1.1 菌株 结核分枝杆菌标准菌株（H37Rv）由国家结核病参比实验室提供，29株临床分离的结核分枝杆菌为我院无落花紫珠治疗史的肺结核病人经痰分枝杆菌培养分离，经菌种鉴定确认。
1.2 材料 裸花紫珠干浸膏，由湖南省九芝堂股份有限公司提供，批号为100910821；7H9培养基为购置美国Sigma公司干粉自配；中性改良罗氏培养基，自配。
1.3方法 配制7H9培养基1000ml，稀释2倍，作为实验培养液。
称取裸花紫珠干浸膏64g溶于1000ml蒸馏水中，即得浓度为64mg/ml裸花紫珠原液，用0.2μm滤膜滤过除菌，将裸花紫珠原液用7H9培养液作1：2倍稀释 ，配制的落花紫珠浓度为64、32、16、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25mg/ml，对照管为7H9培养基培养液，分装，每管9.9ml。
挑取培养3-4周的H37Rv菌株及临床分离株菌落于磨菌管，制备成0.5麦氏单位（1mg/ml）菌悬液。
将0.5麦氏单位H37Rv菌株及临床分离株菌悬液加入相应浓度的裸花紫珠溶液中，每个浓度两管，每管0.1ml。
混匀，于37℃恒温箱放置24小时后转入15ml无菌离心管中，3000g/min离心20min，倾去上清液，加入10ml无菌生理盐水，混匀。菌液分别接种于中性改良罗氏培养基中，每管0.1ml，每个浓度接种2管。
将接种好的培养基放置于37℃恒温培养箱培养4周，每周观察一次结果，第4周末为最终结果，观察受试菌株在对照管及含落花紫珠不同浓度管的生长情况，记录受试菌生长的菌落数。
1.4统计学方法
采用spss 15.0软件，计量资料采用t检验，率的比较采用卡方检验，以p<0.05作为具有统计学差异标准。
3 讨论
结核病是一个严重的全球性疾病。随着艾滋病病毒及耐药结核分枝杆菌的出现及播散成为结核病控制的又一个威胁。虽然我们有结核疫苗及抗结核药物，但控制结核病仍是一件很棘手的事情[8]。多重耐药结核菌的不断出现给结核病的冶疗带来很大的困难。耐药性结核的产生主要由于患者的治疗缺乏规范及对现有西医化疗药物的副作用不能耐受而中断治疗，导致治疗不彻底，结核分枝杆菌对药物产生耐药。既往研究表明，中医药治疗耐药肺结核具有提高机体免疫[7]、改善肺结核中毒症状、减毒增效等作用，裸花紫珠对结核菌的抑菌作用对于从中草药中寻找抗结核有效药物和对结核病的治疗具有重要意义。
本课题以结核分枝杆菌H37Rv标准菌株及无落花紫珠治疗史的肺结核病人临床分离株为受试菌，落花紫珠与受试菌采用直接作用法进行体外抑菌实验及最低抑菌浓度的测定。实验结果表明，裸花紫珠对结核分枝杆菌H37Rv标准菌株耐及临床分离株有明显的抑制作用，其最小抑菌浓度MIC50为4.0mg/ml，MIC90为8.0mg/ml， MIC范围为4.0-8.0mg/ml。实验说明，落花紫珠对结核分枝杆菌的抑菌作用具有重要的研究意义，通过对其进行合理加工，裸花紫珠具有开发成为抗结核病辅助用药的潜在实用价值。但鉴于中药成分复杂，一般通过多组分、多靶点和整体协同作用发挥作用，对中药抗结核的研究开发还需要做更多的研究工作。鉴于本次实验30株受试菌中，耐药株5株，样本量不足，建议可进一步研究落花紫珠在敏感和耐药结核分枝杆菌中的MIC是否存在差异。
参考文献：
[1] 王宇. 分枝杆菌分离培养标准化操作程序及质量保证手册[M].北京：人民卫生出版社，2013，16-20；
[2] 蒋云肺.结核病流行现状和预防对策[J].基层医学论坛，2012，16（7）：922-923.
[3]成君，何广学，成诗明，等.中国结核病防治技术策略实施现状及建议[J].中国防痨杂志，2013，35（10）835-839. [4]江苏新医学院.中药大辞典[M].上海：上海科学技术出版社，1986，1823
[5]郑丽，孙昕，刘恩顺.中医药辅助治疗肺结核的临床研究现状[J].医学综述，2013，19 （12） ：2199-2201.
[6]蔡金平，董琳，关薇薇，等.裸花紫珠的研究进展[J].现代药物与临床，2012，27（1）：60-64.
[7] 陈传军. 结核病现状与防治医学理论与实践[J]. 2011， 24 （15）： 1798-1799.
[8] 郭晓燕，张惠勇，鹿振辉，等. 中医药治疗耐药肺结核的研究进展[J]. 时珍国医国药，2010， 21（8）： 2028-2029.
关键词：裸花紫珠，结核分枝杆菌，抑菌
基金资助：湖南省卫生厅科研基金课题（B2012-119）
结核病仍是我国重大传染性疾病之一，其中最常见的是肺结核病，它是由结核分枝杆菌通过空气传播所致。近年来，临床上大量应用多种可有效控制结核病的药物，如链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺等，但容易产生耐药性，特别是多重耐药性和广泛耐药性结核分枝杆菌的出现，给结核病的治疗带来了严重困难[2]。落花紫珠为马鞭草科紫珠属植物，又名紫珠，主产于我国海南。落花紫珠具有解毒、抗菌消炎、收敛止血、散瘀消肿等多重药理活性，临床上主要与其它中草药配伍，用于治疗化脓性炎症、急性传染性肝炎、呼吸道及消化道出血等疾病及肺结核咯血等症[3-6]。国内已经有将裸花紫珠和西药联用治疗肺结核的临床应用[7]，但对结核分枝杆菌的抑菌效果尚未有文献报道。自2013年2月至2014年2月期间，本课题探讨落花紫珠在体外的抑制作用，测定该药物对结核分枝杆菌的MIC。
1 材料与方法
1.1 菌株 结核分枝杆菌标准菌株（H37Rv）由国家结核病参比实验室提供，29株临床分离的结核分枝杆菌为我院无落花紫珠治疗史的肺结核病人经痰分枝杆菌培养分离，经菌种鉴定确认。
1.2 材料 裸花紫珠干浸膏，由湖南省九芝堂股份有限公司提供，批号为100910821；7H9培养基为购置美国Sigma公司干粉自配；中性改良罗氏培养基，自配。
1.3方法 配制7H9培养基1000ml，稀释2倍，作为实验培养液。
称取裸花紫珠干浸膏64g溶于1000ml蒸馏水中，即得浓度为64mg/ml裸花紫珠原液，用0.2μm滤膜滤过除菌，将裸花紫珠原液用7H9培养液作1：2倍稀释 ，配制的落花紫珠浓度为64、32、16、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25mg/ml，对照管为7H9培养基培养液，分装，每管9.9ml。
挑取培养3-4周的H37Rv菌株及临床分离株菌落于磨菌管，制备成0.5麦氏单位（1mg/ml）菌悬液。
将0.5麦氏单位H37Rv菌株及临床分离株菌悬液加入相应浓度的裸花紫珠溶液中，每个浓度两管，每管0.1ml。
混匀，于37℃恒温箱放置24小时后转入15ml无菌离心管中，3000g/min离心20min，倾去上清液，加入10ml无菌生理盐水，混匀。菌液分别接种于中性改良罗氏培养基中，每管0.1ml，每个浓度接种2管。
将接种好的培养基放置于37℃恒温培养箱培养4周，每周观察一次结果，第4周末为最终结果，观察受试菌株在对照管及含落花紫珠不同浓度管的生长情况，记录受试菌生长的菌落数。
1.4统计学方法
采用spss 15.0软件，计量资料采用t检验，率的比较采用卡方检验，以p<0.05作为具有统计学差异标准。
3 讨论
结核病是一个严重的全球性疾病。随着艾滋病病毒及耐药结核分枝杆菌的出现及播散成为结核病控制的又一个威胁。虽然我们有结核疫苗及抗结核药物，但控制结核病仍是一件很棘手的事情[8]。多重耐药结核菌的不断出现给结核病的冶疗带来很大的困难。耐药性结核的产生主要由于患者的治疗缺乏规范及对现有西医化疗药物的副作用不能耐受而中断治疗，导致治疗不彻底，结核分枝杆菌对药物产生耐药。既往研究表明，中医药治疗耐药肺结核具有提高机体免疫[7]、改善肺结核中毒症状、减毒增效等作用，裸花紫珠对结核菌的抑菌作用对于从中草药中寻找抗结核有效药物和对结核病的治疗具有重要意义。
本课题以结核分枝杆菌H37Rv标准菌株及无落花紫珠治疗史的肺结核病人临床分离株为受试菌，落花紫珠与受试菌采用直接作用法进行体外抑菌实验及最低抑菌浓度的测定。实验结果表明，裸花紫珠对结核分枝杆菌H37Rv标准菌株耐及临床分离株有明显的抑制作用，其最小抑菌浓度MIC50为4.0mg/ml，MIC90为8.0mg/ml， MIC范围为4.0-8.0mg/ml。实验说明，落花紫珠对结核分枝杆菌的抑菌作用具有重要的研究意义，通过对其进行合理加工，裸花紫珠具有开发成为抗结核病辅助用药的潜在实用价值。但鉴于中药成分复杂，一般通过多组分、多靶点和整体协同作用发挥作用，对中药抗结核的研究开发还需要做更多的研究工作。鉴于本次实验30株受试菌中，耐药株5株，样本量不足，建议可进一步研究落花紫珠在敏感和耐药结核分枝杆菌中的MIC是否存在差异。
参考文献：
[1] 王宇. 分枝杆菌分离培养标准化操作程序及质量保证手册[M].北京：人民卫生出版社，2013，16-20；
[2] 蒋云肺.结核病流行现状和预防对策[J].基层医学论坛，2012，16（7）：922-923.
[3]成君，何广学，成诗明，等.中国结核病防治技术策略实施现状及建议[J].中国防痨杂志，2013，35（10）835-839. [4]江苏新医学院.中药大辞典[M].上海：上海科学技术出版社，1986，1823
[5]郑丽，孙昕，刘恩顺.中医药辅助治疗肺结核的临床研究现状[J].医学综述，2013，19 （12） ：2199-2201.
[6]蔡金平，董琳，关薇薇，等.裸花紫珠的研究进展[J].现代药物与临床，2012，27（1）：60-64.
[7] 陈传军. 结核病现状与防治医学理论与实践[J]. 2011， 24 （15）： 1798-1799.
[8] 郭晓燕，张惠勇，鹿振辉，等. 中医药治疗耐药肺结核的研究进展[J]. 时珍国医国药，2010， 21（8）： 2028-2029.