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摘要[目的] 为有效控制鸭大肠杆菌病的流行提供参考依据。[方法] 利用分离自泰州某规模化养鸭场的大肠杆菌菌株TZY1作为菌种，制备鸭大肠杆菌铝胶灭活苗，并进行相应的质量检验。[结果] 通过无菌检验、安全检验和动物保护力试验发现自制疫苗无外源性微生物污染，对雏鸭安全性好。对雏鸭的攻毒试验结果表明制备疫苗的免疫保护率达100%，该疫苗的免疫剂量为0.5 ml。田间试验结果表明免疫保护率达95.1%。[结论] 成功制备了鸭大肠杆菌铝胶灭活苗。
关键词鸭；大肠杆菌；铝胶；灭活苗；制备
中图分类号S834文献标识码A文章编号0517-6611（2014）36-12929-02
Abstract[Objective] The research aimed to provide reference basis for controlling the prevalence of duck colibacillosis effectively. [Method] TZY1 strain of Escherichia coli separated from a largescale duck farm in Taizhou was used to prepare the aluminum hydroxide inactivated vaccine against Escherichia coli of duck. And its quality indices were examined. [Result] The results of sterilization test， safety examination and animal protection test showed that the selfprepared vaccine wasn’t polluted by exogenous microorganisms and it had good safety to ducklings. The results of challenge experiment on ducklings showed that the immune protection rate of the selfprepared vaccine reached 100% and its immunization dose was 0.5 ml. The results of field experiment shoed that the immune protection rate was 95.1%. [Conclusion] Aluminum hydroxide inactivated vaccine against Escherichia coli of duck was successfully prepared.
Key wordsDuck； Escherichia coli； Aluminum hydroxide； Inactivated vaccine； Preparation
鸭大肠杆菌病是由某些致病血清型的大肠杆菌引起的鸭较为常见的细菌性疾病[1]。随着泰州地区养鸭业的规模化发展，鸭大肠杆菌病发病严重，死亡率高，给当地养鸭业带来了巨大的经济损失。在养鸭生产中，使用抗菌药物是治疗鸭大肠杆菌病的主要方法，但由于大肠杆菌容易产生耐药性，导致该病的药物治疗效果并不理想。接种疫苗是控制传染病的有效措施之一，但我国目前已报道的鸭源致病性大肠杆菌血清型约有50余种，不同地区有一定差异[2]，市场上很难买到有效疫苗来预防鸭大肠杆菌病。笔者利用分离自泰州发病鸭场的大肠杆菌菌株研制鸭大肠杆菌自家铝胶灭活苗，并进行了相应的质量检验，以期为有效控制鸭大肠杆菌病的流行提供参考依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株。
制苗用菌株和攻毒用菌株均为致病性鸭大肠杆菌TZY1，由泰州某规模化养鸭场大肠杆菌发病鸭的肝脏中分离、鉴定并保存。
1.1.2试剂。
普通肉汤培养基、麦康凯培养基、硫乙醇酸盐培养基（TG）、酪胨琼脂（GA）、葡萄糖蛋白胨汤（GP）、麦氏比浊管、甲醛溶液、三氯化铝、氢氧化钠等。
1.1.3仪器。
高压蒸汽灭菌器、电热恒温培养箱、振荡培养箱、电子天平、精密试纸、净化工作台、离心机、冰箱等。
1.1.4试验动物。5日龄未接种大肠杆菌病疫苗的健康雏鸭与19日龄未接种大肠杆菌病疫苗的健康鸭，均由泰州某规模化养鸭场提供。
1.2方法
1.2.1氢氧化铝胶（简称铝胶）的制备。
配制4%氢氧化钠溶液和8%三氯化铝溶液，向8%三氯化铝溶液中缓慢加入4%氢氧化钠溶液，边搅拌边加入，二者用量比约为1∶1，pH为5.6～6.0，反应体系中的絮状沉淀突然变成均一的乳白色状态，即为终点，继续搅拌10 min，121 ℃下高压灭菌30 min。
1.2.2菌种毒力的测定。
将36只19日龄健康鸭随机分成6组，每组6只。1～5组鸭分别肌肉接种致病性大肠杆菌菌株TZY1的肉汤培养物，菌液浓度为2.5×105 CUF/ml，1～5组剂量依次为0.2、0.4、0.6、0.8、1. 0 ml，第6组为对照组，肌肉接种1 ml的无菌生理盐水，观察1周后记录各组鸭发病、死亡情况，观察病变情况。
1.2.3疫苗制备。
将大肠杆菌菌种划线接种于麦康凯琼脂平板上， 37 ℃下培养18 h，挑取粉红色、圆形隆起、表面光滑、边缘整齐的菌落接种普通肉汤培养基中， 37 ℃下培养18 h，按照《兽药典》方法进行纯粹性检验[3]，合格后即为种子液。按照培养基总量的2%将种子液接种于普通肉汤培养基中，37 ℃下振荡培养18 h。培养菌液用麦氏比浊法进行细菌计数，调整菌液浓度为2×1010 CFU/ml。按照菌液总量的04%加入37%甲醛溶液，37 ℃灭活48 h，在此期间振荡数次。然后，再向灭活菌液中加入20%铝胶佐剂，充分混匀，分装入灭菌的玻璃瓶内，即制成鸭大肠杆菌自家铝胶灭活苗。 1.2.4质量检验。
1.2.4.1无菌检验。
取灭活苗l ml接种于50 ml TG培养基中，37 ℃下培养3 d后，吸取上述培养物分别接种TG小管和GA斜面各2支， 0.2 ml/支，1支置于37 ℃条件下，另1支置于25 ℃条件下，另吸取0.2 ml接种1支GP小管，置于25 ℃条件下，均培养7 d，应无细菌生长。
1.2.4.2安全检验。
5日龄健康雏鸭6只，各肌肉注射疫苗1 ml，观察10 d，应全部健活。
1.2.4.3动物保护力试验。
5日龄健康雏鸭13只随机分成3组：第1组5只鸭各肌肉注射疫苗0.5 ml，第2组5只鸭各肌肉注射疫苗0.2 ml， 第3组3只鸭作为对照组，不接种。接种14 d后，每只鸭各肌肉注射1 MLD的大肠杆菌TZY1株肉汤培养物，观察14 d后记录发病及死亡情况，剖检病死鸭，观察病变病况。
1.2.5田间试验。
从泰州某规模化鸭场分离的大肠杆菌菌株制成的疫苗，给该鸭场5日龄健康雏鸭肌肉接种， 0.5 ml/只，观察应用效果。
2结果与分析
2.1铝胶制备
制备的铝胶为淡灰白色、无臭、细腻的胶体，薄层半透明，静置能析出少量水分，不含有异物，表明制备的铝胶质量优良，可以作为佐剂使用。
2.2毒力测定结果
能使80%～100%的攻毒鸭死亡或发病（攻毒1周内出现精神沉郁、排黄白、黄绿稀粪或有神经症状，能从病鸭肝脏或心血中分离到接种菌）的最小攻毒菌量即为该日龄免疫鸭的攻毒菌量[4]。19日龄鸭攻毒后死亡率为100%时，大肠杆菌最小攻毒菌量为0.6 ml/只。根据试验结果确定大肠杆菌攻毒剂量为0.6 ml/只。
2.3疫苗制备结果
制备的鸭大肠杆菌自家铝胶灭活苗静置后，上层为微黄色澄明液体，下层为灰白色沉淀，振摇后呈均匀混悬液。
2.4质量检验结果
2.4.1无菌检验结果。
灭活苗接种于2支TG小管、2支GA斜面、1支GP小管中培养，观察7 d后5支小管中均无任何细菌生长，表明无菌检验合格。
2.4.2安全检验结果。
接种疫苗后10 d，6只雏鸭全部健活，注射疫苗局部无肿块等严重不良反应，精神、食欲未出现异常，表明制备的疫苗安全可靠。
2.4.3动物保护力。
由表1可知，第3组3只雏鸭，攻毒后发病率和死亡率均为100%，剖检病死鸭，发现心包炎、肝周炎、气囊炎等大肠杆菌的病变特征，从肝脏中均分离到大肠杆菌，表明对照组结果正确，可以对第1组、第2组进行结果判定。由表1可知，第1组雏鸭接种疫苗0.5 ml攻毒后发病率为0，死亡率为0；第2组中雏鸭接种疫苗0.2 ml攻毒后发病率为60%，死亡率为40%，表明鸭大肠杆菌自家铝胶灭活苗接种剂量为0.5 ml时，免疫保护效果最好，可达100%，因此确定该疫苗的接种剂量为0.5 ml。
2.5田间试验结果
将疫苗给大肠杆菌TZY1菌株来源鸭场的6 000只5日龄雏鸭肌肉接种后，未见明显副反应，该场鸭大肠杆菌病的发病率和死亡率明显下降，疫苗免疫保护率达95.1%，商品肉鸭出栏率提高了10.3%，效果较好。
3讨论与结论
（1）刘吉山等[5]从鸡、鸭、猪和兔的内脏中首次分离到多株不同血清型的细菌天然融合株O2/O86、O1/O154、O8/O93、O53/O80、O4/O18/O142、O1/O148、O35/O107/O154等菌株，意味着细菌的血清型正向更多、更复杂、感染谱更广的方向发展，因此制备疫苗时最好根据当地流行的血清型制备疫苗，以使疫苗的针对性更强，预防疫病效果更好。笔者利用从泰州病死鸭肝组织中分离的大肠杆菌菌株作为菌种制备疫苗，动物保护力试验中免疫保护率高达100%，田间试验中免疫保护率高达95.1%，可能与所用菌株针对性较强有关。
（2）在灭活过程中，灭活疫苗免疫原性会受到一定程度的破坏，为了提高灭活疫苗的免疫效果，灭活后加入佐剂进行配苗。目前，兽医生物制品生产中常用佐剂有铝胶、矿物油和蜂胶等，其中铝胶因安全无毒、成本低廉、使用方便而应用最广泛。该研究所用佐剂为自制的铝胶佐剂，经检验佐剂的性状、胶态和吸附力等方面均符合制造兽医生物制品用铝胶的标准[3]，这可能也是该疫苗免疫保护效果好的原因之一。但是，铝胶佐剂不能抗低温，上冻的铝胶疫苗容易变性，从而导致失效，因此该研究制备的铝胶疫苗要在2～8 ℃冰箱中冷藏保存，不能冷冻保存。
以泰州某规模化养鸭场分离的鸭源大肠杆菌菌株TZY1为菌种，制备种子液，培养菌液，经甲醛灭活后加入铝胶佐剂配苗，最终制成鸭大肠杆菌自家铝胶灭活苗，无菌检验、安全检验、动物保护力试验表明制备的疫苗灭菌彻底、无外源性微生物污染，对雏鸭安全性好，每只雏鸭肌肉接种0.5 ml，14 d后进行攻毒，发病率和死亡率均为0，免疫保护率达100%，确定该疫苗的免疫剂量为0.5 ml，用该疫苗进行田间试验，免疫保护率达95.1%，表明该研究制备的鸭大肠杆菌病自家铝胶灭活苗安全可靠，免疫效果好。
参考文献
[1] 蒋新华，张文波，熊莉娟.一株鸭致病性大肠杆菌的分离鉴定及耐药分析[J]. 中国家禽，2012，34（5）：20-22.
[2] 李刚.邹平县鸭源大肠杆菌分离鉴定及耐药性检测[J].中国动物检疫，2013，30（12）：66-70.
[3] 中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典：2010年版.三部[S].北京：中国农业出版社，2011.
[4] 李振清.鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌二联自场疫苗的研制[J].中国畜牧兽医，2012，39（12）：180-182.
[5] 刘吉山，沈志强，王燕，等.我国部分地区禽致病性大肠杆菌的分离鉴定与药敏试验[J].中国家禽，2005，27（7）：14-16.
关键词鸭；大肠杆菌；铝胶；灭活苗；制备
中图分类号S834文献标识码A文章编号0517-6611（2014）36-12929-02
Abstract[Objective] The research aimed to provide reference basis for controlling the prevalence of duck colibacillosis effectively. [Method] TZY1 strain of Escherichia coli separated from a largescale duck farm in Taizhou was used to prepare the aluminum hydroxide inactivated vaccine against Escherichia coli of duck. And its quality indices were examined. [Result] The results of sterilization test， safety examination and animal protection test showed that the selfprepared vaccine wasn’t polluted by exogenous microorganisms and it had good safety to ducklings. The results of challenge experiment on ducklings showed that the immune protection rate of the selfprepared vaccine reached 100% and its immunization dose was 0.5 ml. The results of field experiment shoed that the immune protection rate was 95.1%. [Conclusion] Aluminum hydroxide inactivated vaccine against Escherichia coli of duck was successfully prepared.
Key wordsDuck； Escherichia coli； Aluminum hydroxide； Inactivated vaccine； Preparation
鸭大肠杆菌病是由某些致病血清型的大肠杆菌引起的鸭较为常见的细菌性疾病[1]。随着泰州地区养鸭业的规模化发展，鸭大肠杆菌病发病严重，死亡率高，给当地养鸭业带来了巨大的经济损失。在养鸭生产中，使用抗菌药物是治疗鸭大肠杆菌病的主要方法，但由于大肠杆菌容易产生耐药性，导致该病的药物治疗效果并不理想。接种疫苗是控制传染病的有效措施之一，但我国目前已报道的鸭源致病性大肠杆菌血清型约有50余种，不同地区有一定差异[2]，市场上很难买到有效疫苗来预防鸭大肠杆菌病。笔者利用分离自泰州发病鸭场的大肠杆菌菌株研制鸭大肠杆菌自家铝胶灭活苗，并进行了相应的质量检验，以期为有效控制鸭大肠杆菌病的流行提供参考依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株。
制苗用菌株和攻毒用菌株均为致病性鸭大肠杆菌TZY1，由泰州某规模化养鸭场大肠杆菌发病鸭的肝脏中分离、鉴定并保存。
1.1.2试剂。
普通肉汤培养基、麦康凯培养基、硫乙醇酸盐培养基（TG）、酪胨琼脂（GA）、葡萄糖蛋白胨汤（GP）、麦氏比浊管、甲醛溶液、三氯化铝、氢氧化钠等。
1.1.3仪器。
高压蒸汽灭菌器、电热恒温培养箱、振荡培养箱、电子天平、精密试纸、净化工作台、离心机、冰箱等。
1.1.4试验动物。5日龄未接种大肠杆菌病疫苗的健康雏鸭与19日龄未接种大肠杆菌病疫苗的健康鸭，均由泰州某规模化养鸭场提供。
1.2方法
1.2.1氢氧化铝胶（简称铝胶）的制备。
配制4%氢氧化钠溶液和8%三氯化铝溶液，向8%三氯化铝溶液中缓慢加入4%氢氧化钠溶液，边搅拌边加入，二者用量比约为1∶1，pH为5.6～6.0，反应体系中的絮状沉淀突然变成均一的乳白色状态，即为终点，继续搅拌10 min，121 ℃下高压灭菌30 min。
1.2.2菌种毒力的测定。
将36只19日龄健康鸭随机分成6组，每组6只。1～5组鸭分别肌肉接种致病性大肠杆菌菌株TZY1的肉汤培养物，菌液浓度为2.5×105 CUF/ml，1～5组剂量依次为0.2、0.4、0.6、0.8、1. 0 ml，第6组为对照组，肌肉接种1 ml的无菌生理盐水，观察1周后记录各组鸭发病、死亡情况，观察病变情况。
1.2.3疫苗制备。
将大肠杆菌菌种划线接种于麦康凯琼脂平板上， 37 ℃下培养18 h，挑取粉红色、圆形隆起、表面光滑、边缘整齐的菌落接种普通肉汤培养基中， 37 ℃下培养18 h，按照《兽药典》方法进行纯粹性检验[3]，合格后即为种子液。按照培养基总量的2%将种子液接种于普通肉汤培养基中，37 ℃下振荡培养18 h。培养菌液用麦氏比浊法进行细菌计数，调整菌液浓度为2×1010 CFU/ml。按照菌液总量的04%加入37%甲醛溶液，37 ℃灭活48 h，在此期间振荡数次。然后，再向灭活菌液中加入20%铝胶佐剂，充分混匀，分装入灭菌的玻璃瓶内，即制成鸭大肠杆菌自家铝胶灭活苗。 1.2.4质量检验。
1.2.4.1无菌检验。
取灭活苗l ml接种于50 ml TG培养基中，37 ℃下培养3 d后，吸取上述培养物分别接种TG小管和GA斜面各2支， 0.2 ml/支，1支置于37 ℃条件下，另1支置于25 ℃条件下，另吸取0.2 ml接种1支GP小管，置于25 ℃条件下，均培养7 d，应无细菌生长。
1.2.4.2安全检验。
5日龄健康雏鸭6只，各肌肉注射疫苗1 ml，观察10 d，应全部健活。
1.2.4.3动物保护力试验。
5日龄健康雏鸭13只随机分成3组：第1组5只鸭各肌肉注射疫苗0.5 ml，第2组5只鸭各肌肉注射疫苗0.2 ml， 第3组3只鸭作为对照组，不接种。接种14 d后，每只鸭各肌肉注射1 MLD的大肠杆菌TZY1株肉汤培养物，观察14 d后记录发病及死亡情况，剖检病死鸭，观察病变病况。
1.2.5田间试验。
从泰州某规模化鸭场分离的大肠杆菌菌株制成的疫苗，给该鸭场5日龄健康雏鸭肌肉接种， 0.5 ml/只，观察应用效果。
2结果与分析
2.1铝胶制备
制备的铝胶为淡灰白色、无臭、细腻的胶体，薄层半透明，静置能析出少量水分，不含有异物，表明制备的铝胶质量优良，可以作为佐剂使用。
2.2毒力测定结果
能使80%～100%的攻毒鸭死亡或发病（攻毒1周内出现精神沉郁、排黄白、黄绿稀粪或有神经症状，能从病鸭肝脏或心血中分离到接种菌）的最小攻毒菌量即为该日龄免疫鸭的攻毒菌量[4]。19日龄鸭攻毒后死亡率为100%时，大肠杆菌最小攻毒菌量为0.6 ml/只。根据试验结果确定大肠杆菌攻毒剂量为0.6 ml/只。
2.3疫苗制备结果
制备的鸭大肠杆菌自家铝胶灭活苗静置后，上层为微黄色澄明液体，下层为灰白色沉淀，振摇后呈均匀混悬液。
2.4质量检验结果
2.4.1无菌检验结果。
灭活苗接种于2支TG小管、2支GA斜面、1支GP小管中培养，观察7 d后5支小管中均无任何细菌生长，表明无菌检验合格。
2.4.2安全检验结果。
接种疫苗后10 d，6只雏鸭全部健活，注射疫苗局部无肿块等严重不良反应，精神、食欲未出现异常，表明制备的疫苗安全可靠。
2.4.3动物保护力。
由表1可知，第3组3只雏鸭，攻毒后发病率和死亡率均为100%，剖检病死鸭，发现心包炎、肝周炎、气囊炎等大肠杆菌的病变特征，从肝脏中均分离到大肠杆菌，表明对照组结果正确，可以对第1组、第2组进行结果判定。由表1可知，第1组雏鸭接种疫苗0.5 ml攻毒后发病率为0，死亡率为0；第2组中雏鸭接种疫苗0.2 ml攻毒后发病率为60%，死亡率为40%，表明鸭大肠杆菌自家铝胶灭活苗接种剂量为0.5 ml时，免疫保护效果最好，可达100%，因此确定该疫苗的接种剂量为0.5 ml。
2.5田间试验结果
将疫苗给大肠杆菌TZY1菌株来源鸭场的6 000只5日龄雏鸭肌肉接种后，未见明显副反应，该场鸭大肠杆菌病的发病率和死亡率明显下降，疫苗免疫保护率达95.1%，商品肉鸭出栏率提高了10.3%，效果较好。
3讨论与结论
（1）刘吉山等[5]从鸡、鸭、猪和兔的内脏中首次分离到多株不同血清型的细菌天然融合株O2/O86、O1/O154、O8/O93、O53/O80、O4/O18/O142、O1/O148、O35/O107/O154等菌株，意味着细菌的血清型正向更多、更复杂、感染谱更广的方向发展，因此制备疫苗时最好根据当地流行的血清型制备疫苗，以使疫苗的针对性更强，预防疫病效果更好。笔者利用从泰州病死鸭肝组织中分离的大肠杆菌菌株作为菌种制备疫苗，动物保护力试验中免疫保护率高达100%，田间试验中免疫保护率高达95.1%，可能与所用菌株针对性较强有关。
（2）在灭活过程中，灭活疫苗免疫原性会受到一定程度的破坏，为了提高灭活疫苗的免疫效果，灭活后加入佐剂进行配苗。目前，兽医生物制品生产中常用佐剂有铝胶、矿物油和蜂胶等，其中铝胶因安全无毒、成本低廉、使用方便而应用最广泛。该研究所用佐剂为自制的铝胶佐剂，经检验佐剂的性状、胶态和吸附力等方面均符合制造兽医生物制品用铝胶的标准[3]，这可能也是该疫苗免疫保护效果好的原因之一。但是，铝胶佐剂不能抗低温，上冻的铝胶疫苗容易变性，从而导致失效，因此该研究制备的铝胶疫苗要在2～8 ℃冰箱中冷藏保存，不能冷冻保存。
以泰州某规模化养鸭场分离的鸭源大肠杆菌菌株TZY1为菌种，制备种子液，培养菌液，经甲醛灭活后加入铝胶佐剂配苗，最终制成鸭大肠杆菌自家铝胶灭活苗，无菌检验、安全检验、动物保护力试验表明制备的疫苗灭菌彻底、无外源性微生物污染，对雏鸭安全性好，每只雏鸭肌肉接种0.5 ml，14 d后进行攻毒，发病率和死亡率均为0，免疫保护率达100%，确定该疫苗的免疫剂量为0.5 ml，用该疫苗进行田间试验，免疫保护率达95.1%，表明该研究制备的鸭大肠杆菌病自家铝胶灭活苗安全可靠，免疫效果好。
参考文献
[1] 蒋新华，张文波，熊莉娟.一株鸭致病性大肠杆菌的分离鉴定及耐药分析[J]. 中国家禽，2012，34（5）：20-22.
[2] 李刚.邹平县鸭源大肠杆菌分离鉴定及耐药性检测[J].中国动物检疫，2013，30（12）：66-70.
[3] 中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典：2010年版.三部[S].北京：中国农业出版社，2011.
[4] 李振清.鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌二联自场疫苗的研制[J].中国畜牧兽医，2012，39（12）：180-182.
[5] 刘吉山，沈志强，王燕，等.我国部分地区禽致病性大肠杆菌的分离鉴定与药敏试验[J].中国家禽，2005，27（7）：14-16.