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目的:研究表明牙龈蛋白酶可诱导牙龈上皮细胞、牙龈成纤维细胞等牙周细胞凋亡.本课题组的前期研究发现牙龈蛋白酶呈时间和剂量依赖性诱导成骨细胞凋亡,并与Bcl2家族参与的内在凋亡通路相关.本研究旨在探讨在牙龈蛋白酶诱导成骨细胞凋亡中Bcl2家族促凋亡蛋白Bid的表达、作用及调节机制.
方法:8.348U/L牙龈蛋白酶作用小鼠成骨细胞系MC3T3-E1不同时间点(0、4、8、16、24、48、72h)后,Annexin V/PI双染流式检测细胞凋亡,Western Blotting检测cleaved caspase-3、 Bid、 tBid、 p53、p-p53等蛋白表达水平,Real time PCR检测Bid mRNA表达改变,siRNA特异性抑制Bid的表达,TUNEL染色检测成骨细胞凋亡的改变.
结果:8.348U/L牙龈蛋白酶处理成骨细胞16h发生凋亡，24h达到峰值(P＜0.01);Western Blotting结果显示牙龈蛋白酶呈时间依赖性上调活化的caspase-3，即cleaved caspase-3的蛋白表达。牙龈蛋白酶处理成骨细胞8h后Bid的蛋白表达下降，16h后逐渐上升，48h达到峰值，且在这一过程中伴随着Bid活化形式tBid的蛋白表达逐渐上升，说明Bid参与牙龈蛋白酶诱导的成骨细胞凋亡。ReaItime PCR结果显示牙龈蛋白酶处理成骨细胞4-8h后Bid的mRNA水平表达逐渐升高，16h达峰值，为正常对照组的1.6倍(PP＜0.01)，牙龈蛋白酶抑制剂0.1mM下LCK完全逆转BidmRNA高表达。牙龈蛋白酶呈时间依赖性上调p53和p-p53的蛋白表达，p53抑制剂lOμMPFT-α抑制p53表达及活性后，部分逆转牙龈蛋白酶诱导的Bid mRNA高表达，抑制率为75％(P＜0.05)。TUNEL染色结果显示siRNA特异性抑制Bid的蛋白表达后，部分逆转牙龈蛋白酶诱导的细胞凋亡。
结论:牙龈蛋白酶诱导成骨细胞凋亡过程中促凋亡蛋白Bid表达及活性增强;且通过p53信号通路上调Bid的转录水平。抑制Bid的表达有效保护成骨细胞，说明Bid介导牙龈蛋白酶诱导成骨细胞凋亡。