论文部分内容阅读
目的：探讨热休克蛋白在肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导乳腺癌MDA-MB-435s细胞凋亡中的作用，为进一步探讨HSP抗凋亡机制及乳癌生物治疗提供实验依据。
方法：细胞培养将乳腺癌MDA-MB-435s细胞培养于RPMI 1640培养液中，加入10%灭活胎牛血清，8万U庆大霉素，37℃、5% CO2培养箱内培养。3天换液一次，5～7天传代一次，传代时用0.25%胰蛋白酶及0.02% EDTA混合液消化。将细胞以1×105／ml密度接种于24孔培养板中，每孔放置小盖片，爬片生长24小时。实验分组：将培养细胞分为热休克组(HS)和非热休克组(NHS)，每组分为HS+ TNF-α、NHS+ TNF-α，TNF-α浓度分别为0ng/ml（对照），25 ng/ml，50 ng/ml和100 ng /ml(A0～A3)，作用4小时。热休克组细胞42℃热休克处理1小时，再37℃恢复2小时。DNA片段原位末端标记检测(TUNEI)参照宝灵曼公司试剂盒说明书操作。以不加TdT酶溶液的反应溶液作为实验本底对照，用高三尖杉酯碱（HHT）作用后的细胞作为阳性对照。光镜下观察，经DNA片段原位末端标记后，细胞内有淡黄色至棕黄色的颗粒为凋亡细胞。计数1000个细胞中凋亡细胞的数量为凋亡细胞(A1)。3H-TdR掺入试验：直接检测DNA合成状态，掺入的3H-TdR量越多，细胞合成的DNA就越多，检测所掺入的3H-TdR就可以反映细胞增殖的程度。细胞培养终止前3小时，加入10μl3H-TdR。用0.25%胰蛋白酶与0.02% EDTA混合液消化细胞，每孔加消化液50μl，用细胞收集器将细胞吸咐在玻璃纤维滤纸上。滴加5%-氯醋酸1～2 ml以固定细胞，无水乙醇以脱水、脱色。将滤纸烘干过夜后，放入盛有5 ml闪烁液的测量杯中，放置20分钟后放入β-闪烁仪测定cpm值(countsper minute)，cpm值表示3H-TdR掺入量。
结果：HSP对乳腺癌MDA-MB-435s细胞凋亡的作用：非热休克组(NHS)凋亡指数依TNF-α浓度(A1～A3)不同分别为7.65±1.12、19. 24±1.71和23.25±3.22比对照组(A0)1.01±0.29明显增高(P<0.01)：热休克组(HS)凋亡指数在同浓度TNF-α(A1～A3)诱导下分别为3.16±1.46、5.36±2.55和12. 49±4. 36比对照组(A0)2.56±1.15增高(P<0.01)。而热休克组与非热休克组组间两两相比较凋亡指数均下降(P <0.0l)。表明HSP对乳腺癌MDA-MB-435s细胞具有明显抑制作用，且这种作用与TNF-α呈明显剂量依赖关系。HSP对乳腺癌MDA-MB-435s细胞DNA合成的影响：非热休克组(NHS) cpm值与对照组(AO) 3664. 24±376. 23相比，随着TNF-α浓度增加，呈现下降(P<0.01)，抑制率增加；三种浓度(A1～A3) TNF-α组cpm值分别为1453.45±98. 32、1284. 15±59. 79和1011. 88±76. 39；而热休克组(HS) cpm值与对照组(A0) 7221.63±489.54也呈现下降(P<0.01)，抑制率增加；三组(A1～A3) cpm值分别是5655. 58±185.32、4568.56±198. 77和3644.25±213. 57。热休克组与非热休克组cpm值组间两两相比，HS组比NHS组cpm值上升，表明HSP对由TNF-α抑制乳腺癌MDA-MB-435s细胞的DNA合成具有拮抗作用，这种作用也呈现明显依赖效应。
结论：热休克反应对乳腺癌MDA-MB-435s细胞经TNF-α诱导凋亡具有抑制作用，此作用与TNF-α呈剂量依赖效应。
方法：细胞培养将乳腺癌MDA-MB-435s细胞培养于RPMI 1640培养液中，加入10%灭活胎牛血清，8万U庆大霉素，37℃、5% CO2培养箱内培养。3天换液一次，5～7天传代一次，传代时用0.25%胰蛋白酶及0.02% EDTA混合液消化。将细胞以1×105／ml密度接种于24孔培养板中，每孔放置小盖片，爬片生长24小时。实验分组：将培养细胞分为热休克组(HS)和非热休克组(NHS)，每组分为HS+ TNF-α、NHS+ TNF-α，TNF-α浓度分别为0ng/ml（对照），25 ng/ml，50 ng/ml和100 ng /ml(A0～A3)，作用4小时。热休克组细胞42℃热休克处理1小时，再37℃恢复2小时。DNA片段原位末端标记检测(TUNEI)参照宝灵曼公司试剂盒说明书操作。以不加TdT酶溶液的反应溶液作为实验本底对照，用高三尖杉酯碱（HHT）作用后的细胞作为阳性对照。光镜下观察，经DNA片段原位末端标记后，细胞内有淡黄色至棕黄色的颗粒为凋亡细胞。计数1000个细胞中凋亡细胞的数量为凋亡细胞(A1)。3H-TdR掺入试验：直接检测DNA合成状态，掺入的3H-TdR量越多，细胞合成的DNA就越多，检测所掺入的3H-TdR就可以反映细胞增殖的程度。细胞培养终止前3小时，加入10μl3H-TdR。用0.25%胰蛋白酶与0.02% EDTA混合液消化细胞，每孔加消化液50μl，用细胞收集器将细胞吸咐在玻璃纤维滤纸上。滴加5%-氯醋酸1～2 ml以固定细胞，无水乙醇以脱水、脱色。将滤纸烘干过夜后，放入盛有5 ml闪烁液的测量杯中，放置20分钟后放入β-闪烁仪测定cpm值(countsper minute)，cpm值表示3H-TdR掺入量。
结果：HSP对乳腺癌MDA-MB-435s细胞凋亡的作用：非热休克组(NHS)凋亡指数依TNF-α浓度(A1～A3)不同分别为7.65±1.12、19. 24±1.71和23.25±3.22比对照组(A0)1.01±0.29明显增高(P<0.01)：热休克组(HS)凋亡指数在同浓度TNF-α(A1～A3)诱导下分别为3.16±1.46、5.36±2.55和12. 49±4. 36比对照组(A0)2.56±1.15增高(P<0.01)。而热休克组与非热休克组组间两两相比较凋亡指数均下降(P <0.0l)。表明HSP对乳腺癌MDA-MB-435s细胞具有明显抑制作用，且这种作用与TNF-α呈明显剂量依赖关系。HSP对乳腺癌MDA-MB-435s细胞DNA合成的影响：非热休克组(NHS) cpm值与对照组(AO) 3664. 24±376. 23相比，随着TNF-α浓度增加，呈现下降(P<0.01)，抑制率增加；三种浓度(A1～A3) TNF-α组cpm值分别为1453.45±98. 32、1284. 15±59. 79和1011. 88±76. 39；而热休克组(HS) cpm值与对照组(A0) 7221.63±489.54也呈现下降(P<0.01)，抑制率增加；三组(A1～A3) cpm值分别是5655. 58±185.32、4568.56±198. 77和3644.25±213. 57。热休克组与非热休克组cpm值组间两两相比，HS组比NHS组cpm值上升，表明HSP对由TNF-α抑制乳腺癌MDA-MB-435s细胞的DNA合成具有拮抗作用，这种作用也呈现明显依赖效应。
结论：热休克反应对乳腺癌MDA-MB-435s细胞经TNF-α诱导凋亡具有抑制作用，此作用与TNF-α呈剂量依赖效应。