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[研究背景]肾脏纤维化,包括肾小球硬化和肾小管间质纤维化,是糖尿病肾病,狼疮肾炎等各种肾脏病引发终末期肾功能衰竭的重要原因。目前,越来越多的研究表明肾小管间质纤维化为肾脏功能不可逆的更可靠的指标。在上皮细胞损伤过程及肾小管间质纤维化的发生发展中,肾小管上皮细胞间质转发化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)起着重要作用。多种刺激物可诱导不同信号通路激活或细胞因子的分泌,进而导致EMT的发生发展。本课题组前期研究结果表明晚期氧化蛋白产物(advanced oxidation protein products,AOPPs)能够诱导人肾小管上皮细胞发生EMT现象。然而,EMT的发生及调控机制复杂,AOPPs引起肾小管上皮细胞EMT的机制还有待进一步研究。结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor,CTGF)在EMT的发生发展中起着重要作用,其可通过自身或介导其他因子的作用导致肾脏细胞外基质沉积,但其是否介导AOPPs引起的HK-2细胞EMT过程尚不清楚。另外,CTGF信号路径的研究并不明确,其基因表达可能与多种信号途径相关。有研究表明CTGF既是Wnt/β-catenin通路的上游激活因子,亦可是其下游调控的靶基因。Wnt/β-catenin通路是否介导AOPPs引起的人肾小管上皮细胞CTGF的高表达还有待进一步研究。[目的]本研究以体外培养的人肾小管上皮细胞(human proximal tubular epithelial cells,HK-2)为研究对象,首先探讨AOPPs是否通过诱导HK-2细胞CTGF的高表达而引起其EMT的发生,然后,探讨Wnt/β-catenin通路是否介导了 AOPPs诱导的CTGF的高表达过程,为肾脏纤维化的防治提供新的证据。[方法]首先,HK-2细胞分别与AOPPs(200ug/ml)和未经修饰的白蛋白(200ug/ml)共同孵育,qPCR及Western blot检测HK-2细胞中CTGF mRNA及蛋白表达水平。利用小干扰RNA特异性下调HK-2细胞CTGF的表达后,qPCR,Western blot及免疫荧光检测对照组及AOPPs作用的HK-2细胞E-cadherin,Vimentin及α-SMA的表达情况。其次,HK-2细胞分别与AOPPs及白蛋白共同孵育特定时间,Western blot 检测 HK-2 细胞中 Wnt/β-catenin 通路相关蛋白 p-GSK3β,GSK3β及β-catenin的表达水平。利用Wnt/β-catenin通路特异性阻断剂DKK-1阻断通路后,检测HK-2细胞CTGF,E-cadherin,Vimentin及α-SMA的表达情况。[结果]AOPPs作用于HK-2细胞后引起其CTGF转录及蛋白水平的高表达,干扰下调CTGF的表达后,与对照组相比,AOPPs引起的HK-2细胞的上皮标志蛋白E-cadherin表达上调,间质标志蛋白Vimentin及α-SMA表达下调。另外,与Alb对照组相比,AOPPs亦能引起Wnt/β-catenin通路蛋白GSK3β磷酸化增加,胞核β-catenin上调。DKK-1阻断Wnt/β-catenin通路后,与未阻断组相比,AOPPs引起的HK-2细胞CTGF表达下降,E-cadherin表达上调,Vimentin及α-SMA表达下调。[结论]本研究首次证明CTGF介导AOPPs引起的HK-2细胞上皮间质转分化的过程,Wnt/β-catenin通路调控AOPPs引起的HK-2细胞CTGF高表达过程。