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高致病性禽流感(Highly Pathogenic Avian influenza,HPAI)是由高致病性禽流感病毒(Highly Pathogenic Avian influenza virus,HPAIV)引起的家禽的一种急性呼吸道传染病,具有高发病率和高死亡率特点,持续对家禽养殖业和人类公共卫生安全带来极大威胁。其中,尤以H5亚型HPAI造成的危害最为广泛。2003年以来,H5亚型HPAI在全球60多个国家和地区发生,数亿只家禽和鸟类因此死亡。另外,根据世界卫生组织(WHO)数据,2003年~2019年,全球H5N1流感感染人860例,死亡454例,致死率超过50%。以上数据表明,流感仍是当前家禽养殖业和公共卫生安全的主要威胁之一。因此,只有有效预防和控制HPAI才能保障家禽养殖和公共卫生安全。目前,疫苗仍是禽流感防控的最有效途径。但是,无论是传统灭活疫苗还是新型疫苗,均面临着难以回避的弊端,即基于病毒监测优势毒株研制疫苗的策略需要种毒株不断更新,抗原种类不断增加,无法对潜在的弱势毒株进行全覆盖。因此,研发一种针对流感病毒不同抗原群均能产生保护力的广谱疫苗已成为当前全球流感疫苗研究的热点。为了研究2.3.4.4和2.3.2.1d分支流感病毒HA蛋白优势抗原表位,探索针对H5亚型2种分支病毒设计流感疫苗抗原的可行性。本研究利用H5亚型AIV不同分支抗原代表病毒作为模式病毒(2.3.4.4分支GZ/4184和2.3.2.1d分支LN/007),将2种代表病毒HA基因通过混编PCR扩增(Shuffling PCR)方法进行相互混编,获得随机呈现2种代表病毒碱基特性的混编HA(mHA)基因,并将mHA基因克隆至质粒中,构建pRB21-mHA质粒文库。以缺陷牛痘病毒(rdVV-ΔVP37)和pRB21-mHA文库共感染/转染至细胞的方法构建重组牛痘病毒(rVV-mHA)文库。rVV-mHA文库感染细胞,表达mHA蛋白后,利用不同荧光标记的2种代表病毒HA蛋白的多克隆IgG抗体,结合流式细胞术方法,从rVV-mHA文库中筛选出可以同时结合2种多克隆IgG抗体的rVV-mHA,并对其mHA蛋白抗原结构进行建模分析,寻找2.3.4.4和2.3.2.1d分支代表病毒HA蛋白的优势抗原位点。GZ/4184和LN/007 HA基因通过Shuffling PCR方法进行相互混编后,构建pRB21-mHA文库。结果显示,pRB21-mHA文库阳性率为92.5%,随机挑选的200个mHA基因呈现出2种亲本HA基因的碱基特性且均不相同。表明,成功构建了mHA质粒文库,质粒文库多样性良好。将rdVV-ΔVP37和pRB21-mHA文库共感染/转染至CV-1细胞中,构建rVV-mHA文库。结果显示,rVV-mHA文库阳性率为96%,随机挑选的200个rVV-mHA呈现出2种亲本HA基因的氨基酸特性且均不相同。IFA结果显示,rVV-mHA文库接种的细胞能够检测到绿色荧光,而对照组无荧光。表明,成功构建了rVV-mHA文库,病毒文库多样性良好,并且mHA基因正确表达。rVV-mHA文库感染细胞后,利用不同荧光标记的2种亲本HA蛋白多克隆IgG抗体孵育感染细胞,结合流式细胞术分析方法,筛选rVV-mHA文库。结果显示,利用流式细胞术方法共筛选到26株可同时结合2种亲本HA蛋白多克隆IgG抗体的rVV-mHA,建模后分析结果显示,GZ/4184 HA蛋白潜在优势抗原位点为:120R,124N,126T,127S;66M,82R,86S,71I,72R;124N,141A,LN/007 HA蛋白潜在优势抗原位点为:259K,269V;71T,72N;66L,82K,86A。表明,利用流式细胞术结合荧光IgG抗体孵育的方法去筛选GZ/4184和LN/007 HA蛋白优势抗原位点的方案可行,得到的位点可用于研究针对2.3.4.4分支和2.3.2.1d分支流感病毒具有广谱中和抗性的新型流感疫苗抗原。本研究创新性的利用了DNA shuffling技术挖掘AIV不同Clade分支病毒HA蛋白的优势抗原位点,为设计广谱H5亚型流感病毒抗原提供了理论基础,为新型流感病毒疫苗的研究提供了新途径。