研究背景腹主动脉瘤（Abdominal aortic aneurysm,AAA）是导致成人死亡的重要原因之一,全球每年约有150,000-200,000的人死于腹主动脉瘤。目前,我国AAA的发病率逐年攀升,经超声检查,65岁以上男性AAA的发病率达9%。腹主动脉瘤是由于动脉中层结构破坏,使血管壁遭受血流冲击的压力而致局部或广泛性的永久性扩张,常因主动脉夹层的出现和动脉瘤破裂的发生而导致高死亡率。目前,AAA患者的治疗方法仍局限于手术修复,尚未有有效的药物,这意味着患有小腹主动脉瘤的患者或不适合手术修复的患者缺乏有效的治疗措施,因此,迫切需要探索有效的药物来减缓其进展。AAA的形成是一个多因素参与的过程,主要涉及炎症细胞的浸润、基质金属蛋白酶的降解和平滑肌细胞的凋亡与表型转换。在AAA动物模型中发现,腹主动脉扩张之前即有炎性细胞的浸润,如巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞和CD4+T细胞等。研究表明,免疫炎性细胞浸润是AAA重要发病机制之一,且贯穿于AAA发生发展的全过程。巨噬细胞作为固有免疫系统的效应细胞,在炎症反应中的作用至关重要,它可吞噬细菌及坏死物质并可分泌促炎因子,如白细胞介素（Interleukin,IL）、干扰素（Interferon,IFN）、肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor,TNF）、趋化因子（chemokines）等。我们通过收集AAA患者的腹主动脉组织,利用免疫组织化学染色,也证实了这一观点。此外,既往研究发现,环孢素类和类固醇类抗炎药物可以降低动物模型中AAA的大小;大环内酯类和非类固醇类抗炎药物可以降低人类AAA的生长速度。综上,我们认为深入探讨AAA的炎症反应机制可能为AAA的药物治疗提供依据。ILF3又称为白细胞介素增强结合因子3,其包含两个最主要的蛋白异构体:NF90/NF110,是一种双链RNA（dsRNA）结合蛋白,主要参与mRNA的运输、翻译、转录和信号传导等不同的生理活动。以往研究中ILF3被确认为影响血脂异常和卒中亚型的新因子。Xie等人研究表明,ILF3可以介导BMP2的上调和STAT1的下调,从而促进动脉粥样硬化斑块钙化。对颞叶癫痫疾病的研究中发现,ILF3-AS1通过靶向miR-212促进炎症细胞因子和MMPs的表达。此外,研究发现过表达ILF3可抑制miR-215-5p基因的上调,从而对脓毒性H9C2的炎症损伤起抑制作用。以上研究提示ILF3在炎症性疾病和心血管疾病的发生发展中发挥重要作用,但ILF3在AAA中的作用尚未被探讨。为了进一步明确ILF3与AAA的关系,我们提取了小鼠原代腹腔巨噬细胞,并采用了 Ang Ⅱ输注和Cacl2浸润的方式建立AAA模型,以探索ILF3对AAA的具体影响及分子机制。研究目的1、明确ILF3在腹主动脉瘤病变组织中的表达变化,探究病变区域内ILF3表达变化与巨噬细胞的关系。2、阐明巨噬细胞中ILF3在腹主动脉瘤病变进展中的作用机制。3、探究巨噬细胞中ILF3调控Keap1-Nrf2信号通路影响病变局部炎症反应介导AAA发生的分子机制。研究方法1.明确ILF3在腹主动脉瘤病变组织中的表达变化,探究病变区域内ILF3表达变化与巨噬细胞的关系。1.1收集腹主动脉瘤患者与健康人的腹主动脉组织,以及选取8周龄Apoe-/-小鼠,皮下埋入AngⅡ泵或Nacl泵,28天后取材留取小鼠腹主动脉组织。1.1.1利用RT-PCR和Western Blot检测对照组和AAA疾病组中腹主动脉病变区域内ILF3在RNA水平与蛋白质水平的表达情况;1.1.2利用免疫荧光染色方法检测对照组与模型组中ILF3与巨噬细胞标志物CD68的共定位情况。1.2提取ILF3M-WT小鼠的原代腹腔巨噬细胞,加入Ang Ⅱ刺激后,利用Western Blot检测细胞内特定浓度与时间下ILF3表达水平的变化。2.阐明巨噬细胞中ILF3在腹主动脉瘤病变进展中的作用机制。2.1体内实验选取8周龄ILF3M-WT/Apoe-/-（对照组小鼠）、ILF3M-KO/Apoe-/-（特异性巨噬细胞内ILF3基因敲除小鼠）、ILF3M-Tg/Apoe-/-（特异性巨噬细胞内ILF3基因过表达小鼠）,皮下埋入AngⅡ泵或Nacl泵,28天后取材,留取小鼠腹主动脉组织及外周血。2.1.1观察并统计小鼠成瘤率,死亡率,瘤体重量以及瘤体直径大小。2.1.2利用HE染色观察瘤体形态。2.1.3利用Verhoeff染色观察腹主动脉弹力板断裂情况。2.1.4采用免疫组织化学染色观察VCAM、ICAM、MCP1、IL6、IL10、TNF-α等炎症因子的表达情况。2.2体外实验提取ILF3M-WT和ILF3M-KO小鼠的原代腹腔巨噬细胞2.2.1病理（AngⅡ刺激）情况下,利用Western Blot实验,观察巨噬细胞ILF3敲除对炎症因子VCAM、ICAM、MCP1、IL6、IL10、TNF-α表达的变化情况。2.2.2利用明胶酶谱法测定上清基质金属蛋白酶MMPs表达水平。2.2.3利用蛋白质组学测序方法,通过KEGG通路分析并验证ILF3影响腹主动脉瘤进展的具体分子机制。3.探究巨噬细胞中ILF3调控Keap1-Nrf2信号通路影响病变局部炎症反应的分子机制。体外实验提取ILF3M-WT、ILF3M-Tg小鼠的原代腹腔巨噬细胞,利用si-Keap1和NF-κB抑制剂（JSH-23）对ILF3M-Tg小鼠的原代腹腔巨噬细胞进行干预。利用Western Blot实验,观察不同刺激下Keap1、NF-κB通路及炎症因子的表达情况。研究结果1.ILF3在腹主动脉瘤疾病组中升高我们收集了健康人和AAA患者的腹主动脉组织,以及Apoe-/-小鼠的Nacl组和AngⅡ组的腹主动脉组织,利用免疫组织化学染色、PCR实验以及Western Blot实验证实:ILF3在腹主动脉瘤组织中升高。2.ILF3在腹主动脉瘤中与巨噬细胞共定位明显收集健康对照人体和AAA患者的腹主动脉组织,以及Apoe-/-小鼠Nacl泵入组和Ang Ⅱ泵入组的腹主动脉组织,利用免疫组织荧光染色发现:AAA组织内ILF3表达含量显著增加,且与巨噬细胞共定位明显。3.Ang Ⅱ上调巨噬细胞中ILF3的表达提取ILF3M-WT小鼠的原代腹腔巨噬细胞,进行特定浓度和时间点的Ang Ⅱ刺激,利用Western Blot实验表明:巨噬细胞中ILF3的表达增加并与Ang Ⅱ呈现明显的时间和浓度依赖性。4.巨噬细胞ILF3敲除可减缓AAA的病变进展程度,过表达后加剧AAA的病变进展选用Ang Ⅱ泵和Cacl2浸润两种AAA模型,利用HE和VVG染色证实,巨噬细胞ILF3敲除后可以减轻AAA的程度,而巨噬细胞ILF3过表达后AAA加重。5.巨噬细胞ILF3敲除可减轻AAA内的炎症反应提取ILF3M-WT、ILF3M-KO小鼠的原代腹腔巨噬细胞,加入AngⅡ刺激,利用Western Blot实验检测炎症因子的表达,发现巨噬细胞ILF3敲除可以减轻AAA内的炎症反应;此外,我们收集了 ILF3M-WT/Apoe-/-和ILF3M-KO/Apoe-/-小鼠的腹主动脉组织,利用免疫组织化学染色检测两组的炎症因子变化,同样证实巨噬细胞ILF3敲除可以减轻AAA内的炎症反应。6.巨噬细胞ILF3通过Keap1-Nrf2通路和NF-κB通路减轻炎症反应通过蛋白质组学测序发现:巨噬细胞ILF3与Keap1-Nrf2通路和NF-κB通路有关。利用Western Blot实验以及免疫组织化学染色证实:巨噬细胞ILF3敲除可降低Keap1的表达,增加Nrf2的表达,同时抑制NF-κB通路的磷酸化。此外,我们提取了 ILF3M-WT、ILF3M-Tg小鼠的原代腹腔巨噬细胞,加入AngⅡ、si-Keap1以及NF-κB抑制剂（JSH-23）刺激,利用Western Blot实验证实,ILF3通过Keap1-Nrf2通路和NF-κB通路减轻炎症反应。研究结论总之,巨噬细胞ILF3在腹主动脉瘤中扮演着重要角色。研究结果表明,巨噬细胞ILF3敲除后通过抑制炎症反应控制AAA的形成以及严重程度。巨噬细胞ILF3缺失可降低体内Keap1蛋白的表达,减缓体内Nrf2的降解速度,增加Nrf2蛋白含量,并且抑制NF-κB通路的激活从而有效缓解病变局部的炎症反应,抑制腹主动脉瘤病变的进展。