目的:肾细胞癌（Renal cell carcinoma,RCC）是指一类起源于肾小管上皮细胞的恶性肿瘤,占全部肾脏肿瘤病例的90%以上,简称为肾癌。肾细胞癌包括10种以上的组织学和分子亚型,其中透明细胞肾细胞癌（clear cell renal cell carcinoma,cc RCC）是最常见的病理亚型,约占全部肾癌患者的70%。吸烟、肥胖和高血压被认为与肾癌的发病密切相关。局限性肾癌可通过手术切除达到较好的治疗效果,其5年生存率达95%。但是,转移性肾癌对放化疗均不敏感,其5年生存率则下降到20%。最近二十年已经开发出多种靶向药物用于晚期肾癌的治疗,包括酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）和免疫检查点抑制剂（ICIs）等。然而,患者时常面对着难以耐受的药物毒副作用、较低的药物反应率、获得性耐药和经济负担,使得这些药物的临床应用受限。因此,关于肾癌发生发展的分子机制研究,以及晚期肾癌的精准治疗仍是目前大家所面临的难题。通过基因组学研究发现,肾癌存在着广泛的遗传基因突变以及显著的肿瘤内异质性,并与疾病诊断、预后和治疗反应紧密相关。我们已经知道与肾癌相关的基因突变,如VHL、FLCN、TFE3、FH或SDHB等,会改变肿瘤对氧、铁、营养或能量代谢的反应,它们作为肾癌的驱动基因,与疾病的进展及预后密切相关。深入研究这些肾癌驱动基因增加了我们对这种癌症生物学特点的理解,并有助于开发新的靶向治疗药物。因此,本研究聚焦于挖掘新的肾癌差异表达基因,并明确其在肿瘤发生发展中的分子功能及作用机制。含有RAD52基序的蛋白1（RAD52 Motif Containing 1,RDM1）是一个蛋白编码基因,位于染色体17q11.2上。人类RDM1蛋白是由284个氨基酸组成,在睾丸组织中RDM1表达尤为丰富。RDM1蛋白包含两个基序:一个是在RAD52中发现的基序,它在DNA双链断裂修复和同源重组修复中发挥作用;另一个是RNA识别基序（RNA recognition motif,RRM）。既往研究发现,RDM1具有RNA和DNA结合能力,可能参与DNA同源重组修复和DNA双链损伤修复进程。最近,关于RDM1与肿瘤的关系引起了研究者们的兴趣。研究发现,RDM1在人肺腺癌、卵巢癌和乳腺癌中均发挥促癌作用。但是,RDM1是否在肾透明细胞癌的发生发展中发挥作用仍然未知。本课题将深入研究RDM1驱动和调控肾透明细胞癌发生发展的分子机制,将肾透明细胞癌的遗传分子图谱进一步丰富完善,其结果将有助于肾透明细胞癌的预后评估,为精准化、个体化的靶向治疗提供理论基础。研究方法:首先对TCGA数据库中69对cc RCC和癌旁组织样本的全基因m RNA表达情况进行分析,根据其在肿瘤样本中的高表达水平和文献报道中的研究意义,我们发现了22个可能与cc RCC相关的基因。随后在肾透明细胞癌786-O细胞系中转染短发卡RNA（sh RNA）敲减上述目的基因,利用Celigo细胞计数仪动态检测细胞活力,发现敲减ERCC6L、PLEKHO1、GLYATL2、OIP5和RDM1显著抑制肿瘤细胞增殖。其中,基因ERCC6L、PLEKHO1和OIP5在肾癌中的相关研究已见报道。通过分析TCGA数据库,初步明确RDM1 m RNA在肾透明细胞癌组织中表达情况及与疾病进展和患者预后的关系。通过收集临床cc RCC手术标本并获取患者临床病理资料,利用RT-q PCR技术分析RDM1 m RNA在肾透明细胞癌组织中与癌旁组织中的表达差异。进一步系统性构建了肾透明细胞癌组织芯片（TMA）,利用免疫组织化学（IHC）技术检测RDM1的表达情况,并绘制生存曲线。在功能实验上,利用慢病毒转染技术,在肾癌786-O及caki-1细胞系中敲减RDM1的表达,观察对细胞增殖及克隆形成能力的影响。利用流式细胞术观察敲减RDM1对细胞周期分布和细胞凋亡的影响。利用CCK8和克隆形成实验检测过表达RDM1对肾癌细胞增殖的影响,同时利用CCK8实验检测过表达RDM1后肾癌细胞对铂类化疗的反应。进一步构建裸鼠皮下移植瘤模型,观察沉默RDM1对肾癌细胞皮下成瘤能力的影响。在分子机制上,利用基因芯片及生物信息学技术,分析敲减RDM1后下游基因转录水平的变化,确定RDM1下游靶蛋白为MCM2,并利用PCR和蛋白免疫印迹法验证上述关键基因及蛋白的变化。利用免疫共沉淀及免疫荧光技术,观察RDM1和MCM2之间是否存在直接相互作用及细胞内定位情况。通过回复实验,检测回补MCM2是否能够挽救敲减RDM1所引起的细胞表型变化。最后再次利用TMA数据,分析RDM1与MCM2在肾透明细胞癌组织内的表达及定位相关性,对患者的预后进行联合分析。结果:1.本研究通过分析TCGA数据库,发现RDM1 m RNA在肾透明细胞癌组织中上调,并且与疾病进展及不良预后相关。在肾透明细胞癌组织样本中RDM1 m RNA水平明显高于癌旁正常肾组织（p＜0.001）。在肾透明细胞癌组织芯片（TMA）中检测发现RDM1的表达水平明显高于正常肾组织（p＜0.05）,并且RDM1高表达组的患者总体生存率明显低于RDM1低表达组。2.在肾癌786-O及caki-1细胞系中,敲减RDM1明显抑制细胞增殖及克隆形成能力。利用流式细胞术观察到敲减RDM1使细胞周期阻滞在G1期,细胞凋亡率明显升高。在裸鼠皮下移植瘤实验中,敲减RDM1显著抑制肾癌细胞皮下成瘤能力。此外,过表达RDM1并不影响肾癌细胞增殖及对铂类化疗药物的敏感性。3.利用基因芯片及生物信息学技术,预测RDM1的下游靶基因为MCM2。差异表达RDM1可导致MCM2在m RNA及蛋白水平出现相应的联动变化。免疫荧光分析观察到RDM1和MCM2在细胞核内存在共定位,而免疫共沉淀实验提示二者在蛋白水平无直接互作。4.通过分析临床肾透明细胞癌组织样本,发现RDM1和MCM2的m RNA表达水平成正相关。基于TMA数据,研究发现RDM1和MCM2在肾透明细胞癌组织中存在细胞内共定位,并且RDM1和MCM2均高表达的患者其总体预后更差。结论:本研究发现RDM1是肾透明细胞癌的潜在癌基因,在肾透明细胞癌患者中进行RDM1表达量的筛查,可能有助于评估患者的预后。本研究揭示了RDM1-MCM2信号轴可能调控肾透明细胞癌的发生发展,为挖掘新的药物作用靶点提供了一定的理论基础,靶向RDM1可能成为晚期肾透明细胞癌治疗的新选择。