研究背景:目前,结直肠癌（colorectal cancer,CRC）在全球范围内的发病率已升至第三位、致死率升至第二位的恶性肿瘤,不但严重影响人类生命健康,更为社会带来很大的经济负担。虽然临床上针对结直肠癌治疗的手段多样,包括经典的细胞毒药物化疗、靶向治疗、免疫疗法等,但是仍有部分患者不能从中有效获益。临床治疗获益差的原因除了归咎于遗传因素外,还源于其发病机理错综复杂,发生发展又是一个漫长、多因素、多步骤共同参与的累积过程。人类基因组中,一些长度大于200个核苷酸的长链非编码RNAs（Long non-coding RNAs,LncRNAs）因不具备编码蛋白质的潜能,而被认为是基因沙漠区转录的“噪音”。然而,越来越多的研究证实其在肿瘤病理演化及介导药物抵抗进程中发挥至关重要的作用,备受关注。因此,探讨LncRNA分子标记、阐释其作用的关键蛋白以及内在调控方式或者互作模式,将为肿瘤早期预警、预后评估及靶向抗肿瘤药物研发提供新靶标和诊治新策略。研究表明,LncRNA是一类没有或低编码能力的RNA,依靠其二级结构与蛋白、mi RNA及m RNA等直接结合,作为肿瘤发生起始、生长及侵袭转移的调控因子,参与肿瘤增殖与周期、凋亡与分化等诸多生物学功能,也正因此成为学术界追逐的明星分子,尤其是在肿瘤特征与功能研究领域。LncRNA在发育及基因表达层面发挥的精确而复杂的调控方式,很大程度上揭示了肿瘤演变进程及介导药物抵抗的关键所在,但其内在作用方式、调控模式及介导肿瘤病理特征中的分子机制仍认知有限,尚待解析和探索。最新研究发现,小核仁RNA宿主基因（SNHGs）作为LncRNAs参与调控乳腺癌、结直肠癌、肺癌、肝癌等多种肿瘤的细胞增殖、侵袭、转移等生物学特性的改变。LncRNA SNHGs家族已经被发现包括SNHG1到SNHG22等至少22个家族成员,大多数成员均是表观分子生物学领域的追踪热点分子。其中,LncRNA SNHG8（small nucleolar RNA host gene 8,核仁小分子RNA宿主基因8）作为LncRNA SNHGs家族的关键成员之一,具有调控多种肿瘤生物学表型与功能的作用。虽然目前证实LncRNA SNHG8参与调控乳腺癌、结直肠癌、胃癌等病理进程,但是以往研究主要集中在经典的内源竞争性RNA（competing endogenous RNAs,ce RNA）机制进行了初步验证。那么,除了经典的ce RNA机制以外,结直肠癌中存在哪些内源性被LncRNA SNHG8靶向识别并特异调控的分子靶标?调控方式以及内在分子机制如何?尚待阐明。研究报道,LncRNA可以通过蛋白翻译水平参与各种生物学功能调控,而在蛋白翻译的整个过程中,蛋白翻译起始是蛋白质合成的限速步骤,涉及到多种翻译起始因子的参与和调控。蛋白翻译失调在肿瘤发生发展过程中的作用尤为显著,而翻译起始在细胞增殖、分化和凋亡等生理调节中起关键作用。真核细胞翻译起始因子4A3（eukaryotic translation initiation factor 4A,eIF4A3）是DEAD盒RNA解旋酶的家族主要成员之一,在蛋白质翻译起始中起到至关重要作用。由此可见,eIF4A3在肿瘤发生发展进程中扮演着至关重要的角色,那么,LncRNA SNHG8是否具有靶向调控eIF4A3表达介导肿瘤表型及病理演变的作用?是直接还是间接调控eIF4A3蛋白?作用模式以及结合位置如何?下游调控哪些关键因子?值得深入探讨。本研究基于结直肠癌中LncRNA SNHG8与eIF4A3表达与调控关系为切入点展开研究,研究主要内容及结果分为三部分,现分述如下:第一部分:结直肠癌细胞和组织中验证LncRNA SNHG8与eIF4A3表达及其与临床病理参数及预后的相关性目的:本部分集中考察LncRNA SNHG8和eIF4A3在结直肠癌组织和细胞中的表达水平、两者表达的相关性及各自在临床预后评估中的意义和临床价值,旨在为后续研究LncRNA SNHG8调控结直肠癌细胞生物学特性与功能提供数据支撑。方法:（1）结直肠癌成对组织LncRNA测序芯片差异表达谱分析LncRNA SNHG8及与之共表达的eIF4A3的表达水平及差异表达情况。（2）基于肿瘤基因组图谱（TCGA）数据以及生物信息学在线平台分析LncRNA SNHG8和eIF4A3在肿瘤包括结直肠癌中的差异表达及相关性情况。（3）实时荧光定量PCR（q RT-PCR）对比验证7种结直肠癌细胞与正常肠上皮细胞系、29对结直肠癌组织及癌旁组织中LncRNA SNHG8和eIF4A3的表达情况及两者表达的相关性。（4）组织原位杂交法检测125对结直肠癌与癌旁组织中LncRNA SNHG8表达情况;免疫组织化学方法检测上述组织中eIF4A3表达情况;ROC曲线法分析LncRNA SNHG8及eIF4A3高/低表达的分界值（cutoff）及分析两者表达相关性。（5）Logistic回归分析LncRNA SNHG8及eIF4A3的高/低与临床病理参数的相关性;Log-rank检验和多因素Cox预后评估同步分析LncRNA SNHG8、eIF4A3高/低表达与结直肠癌患者预后生存期的相关性。结果:（1）本研究基于GEO芯片数据集GSE137511,分析结直肠癌组织中lncRNAs-m RNAs芯片差异表达谱情况,结果发现LncRNA SNHG8和eIF4A3均异常高表达（log2 FC分别为3.45和4.22）。结直肠癌细胞系和成对组织检测到LncRNA SNHG8和eIF4A3均在结直肠癌中异常高表达;进一步分析结直肠癌TCGA数据发现LncRNA SNHG8和eIF4A3在结直肠癌中上调最为显著,且呈显著正相关（P＜0.0001）。29对结直肠癌组织中同样发现LncRNA SNHG8和eIF4A3呈明显的正相关（r=0.5375,P=0.0022）。（2）结直肠癌组织中检测LncRNA SNHG8与eIF4A3蛋白的各自表达水平及相关性:与癌旁组织相比,LncRNA SNHG8和eIF4A3蛋白在结直肠癌组织中的阳性表达率显著升高（P＜0.0001）,且LncRNA SNHG8和eIF4A3的表达水平呈显著正相关（P=0.009）。（3）LncRNA SNHG8、eIF4A3表达与结直肠癌临床病理参数的相关性分析:经ROC曲线法分别确定LncRNA SNHG8和eIF4A3高/低表达的cutoff值后,采用Pearsonχ~2检验及校正Logistic回归分析LncRNA SNHG8和eIF4A3高/低表达与本研究纳入的结直肠癌患者病理参数之间的相关性,发现LncRNA SNHG8和eIF4A3高/低表达分布与肿瘤原发位置、占肠周环比、DFS及OS生存期存在显著相关性。（4）LncRNA SNHG8、eIF4A3作为独立预后风险标志物影响患者生存期:应用Kaplan-Meier法的单因素Log-rank检验、多因素Cox回归风险模型均验证到LncRNA SNHG8和eIF4A3高/低表达水平与患者DFS及OS相关联,即LncRNA SNHG8、eIF4A3高表达与结直肠癌患者预后生存期缩短相关联、提示其可作为独立预后风险因子用于评估模型构建或生存期评估。结论:（1）本实验利用LncRNA芯片表达谱、TCGA数据以及生物信息学理论预测评估平台数据集,解析和富集LncRNA差异及靶基因共表达调控网络的基础上,鉴定到LncRNA SNHG8与之富集共表达的真核细胞翻译起始因子eIF4A3在7株结直肠癌细胞株、29例结直肠癌患者病理组织中出现显著表达上调（P＜0.0001）;且两者高表达水平在结直肠癌中呈现显著线性正相关（P＜0.0001）。（2）本实验利用纳入的结直肠癌临床病理组织及与之匹配的癌旁组织为对照（n=125）,探索候选指标LncRNA SNHG8和eIF4A3的临床潜在价值,结果发现LncRNA SNHG8和eIF4A3不仅在结直肠癌组织中异常高表达,而且与临床病理参数如占肠周环比、原发位置等密切相关。更为重要的是,LncRNA SNHG8和eIF4A3高表达与结直肠癌患者预后（DFS和OS）不良相关,提示两者可作为预后风险评估候选标记用于结直肠癌预后生存期的评估。第二部分:LncRNA SNHG8靶向调控eIF4A3表达介导结直肠癌细胞生物学特性与作用目的:本部分主要解析干扰LncRNA SNHG8表达调控结直肠癌细胞生物学特性与功能以及与调控下游效应分子eIF4A3表达的相关性,旨在揭示LncRNA SNHG8通过调控eIF4A3表达影响结直肠癌细胞表型与功能的改变。方法:（1）采用q RT-PCR法检测结直肠癌细胞系、结直肠癌组织中LncRNA SNHG8和eIF4A3表达水平;考察HCT116和SW620细胞中,给予LncRNA SNHG8沉默或过表达质粒处理前后,LncRNA SNHG8和eIF4A3 m RNA表达水平变化。恢复验证时,给予LncRNA SNHG8沉默联合eIF4A3过表达双干预后,检测LncRNA SNHG8和eIF4A3 m RNA恢复情况。（2）免疫荧光和蛋白免疫印迹（Western Blot）方法考察HCT116和SW620细胞中沉默或过表达LncRNA SNHG8后,结直肠癌细胞中eIF4A3蛋白表达变化情况。恢复验证时,给予LncRNA SNHG8沉默联合eIF4A3过表达双干预后,检测上述细胞中eIF4A3蛋白表达恢复情况。（3）应用MTT[3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐]方法检测HCT116和SW620细胞中沉默或过表达LncRNA SNHG8后,结直肠癌细胞的生长与增殖活性的变化情况。恢复验证时,给予LncRNA SNHG8沉默联合eIF4A3过表达双干预后,检测上述细胞增殖与存活能力的恢复情况。（4）细胞周期检测:采用流式细胞术检测沉默或过表达LncRNA SNHG8后,PI单染后HCT116和SW620细胞周期或S期增殖百分率的变化。恢复验证时,给予LncRNA SNHG8沉默联合eIF4A3过表达双干预后,检测上述细胞周期恢复情况。（5）细胞凋亡检测:采用流式细胞术检测沉默或过表达LncRNA SNHG8,PE/7AAD双染后HCT116和SW620细胞凋亡百分率变化。恢复验证时,给予LncRNA SNHG8沉默联合eIF4A3过表达双干预后,检测上述细胞凋亡恢复情况。（6）侵袭迁移能力检测:采用Trans-well法检测沉默或过表达LncRNA SNHG8后,HCT116和SW620细胞侵袭、迁移能力变化。恢复验证时,给予LncRNA SNHG8沉默联合eIF4A3过表达双干预后,检测上述细胞迁移能力恢复情况。结果:（1）结直肠癌细胞系中验证干预LncRNA SNHG8表达与eIF4A3表达密切相关:q RT-PCR法检测HCT116和SW620细胞株,过表达LncRNA SNHG8能明显促进eIF4A3 m RNA的表达;相反地,沉默LncRNA SNHG8能显著抑制eIF4A3 m RNA表达水平;Western blot及免疫荧光方法发现,过表达LncRNA SNHG8能明显促进HCT116和SW620细胞中eIF4A3蛋白表达;沉默LncRNA SNHG8表达能显著抑制上述细胞中eIF4A3蛋白的表达水平变化。采用q PCR法检测发现双向干预LncRNA SNHG8和eIF4A3后,两者表达水平并无显著统计学差异（P＞0.05）。（2）干预LncRNA SNHG8表达介导结直肠癌细胞增殖与周期变化:MTT法检测过表达LncRNA SNHG8后0、1、2、3、4天时,结直肠癌细胞HCT116和SW620的增殖活性显著提升（P＜0.001）。相反地,沉默LncRNA SNHG8可明显抑制结直肠癌细胞的增殖活性（P＜0.001）。采用PI单染法,流式细胞术检测周期结果发现,过表达LncRNA SNHG8能显著提高上述细胞周期相关指标包括增殖指数（PI）及S期百分比（SPF）的数值（P＜0.001）。沉默LncRNA SNHG8表达则能显著抑制细胞周期的改变,PI指数及SPF值均显著下降（P＜0.001）。MTT法检测结果发现:双干预后上述细胞的增殖能力与活性无显著统计学差异（P＞0.05）。PI单染色法检测双干预模型中上述细胞周期增殖活性的PI指数以及SPF值均无显著统计学差异（P＞0.05）。（3）干预LncRNA SNHG8表达调控结直肠癌细胞侵袭力与凋亡的变化:Trans-well法检测过表达LncRNA SNHG8能显著提高HCT116和SW620结直肠癌细胞的侵袭力（P＜0.0001）。沉默LncRNA SNHG8表达,能显著抑制结直肠癌细胞的侵袭迁移能力（P＜0.0001）。流式细胞术检测发现过表达LncRNA SNHG8能显著抑制上述细胞的凋亡百分率（P＜0.001）。沉默LncRNA SNHG8表达则使细胞凋亡百分率显著提升（P＜0.001）。Trans-well实验结果发现:双干预后HCT116和SW620细胞的侵袭力无显著统计学差异（P＞0.05）。PE/7AAD双染法检测发现双干预模型中上述细胞凋亡百分率均无显著统计学差异（P＞0.05）。结论:本部分通过单干预LncRNA SNHG8或联合干预eIF4A3恢复验证,均发现LncRNA SNHG8在结直肠癌中扮演着癌基因的角色,其可通过正向调控eIF4A3表达,发挥加速细胞增殖、细胞周期、侵袭迁移的能力、同步产生抑制细胞凋亡的作用。这些表型变化可在双干预实验中得到恢复,提示LncRNA SNHG8通过特异调控eIF4A3蛋白表达促进细胞增殖等恶性表型的关键作用,以上为后续揭示LncRNA SNHG8如何靶向识别结合翻译关键因子eIF4A3的调控方式及作用位置等提供关键依据,也为LncRNAs转录及转录后层面参与致癌机理、新药靶标及治疗策略方面提供数据支撑。第三部分:LncRNA SNHG8靶向结合eIF4A3蛋白调控结直肠癌细胞增殖的关键序列及作用方式目的:第三部分主要集中在研究LncRNA SNHG8靶向识别、特异募集eIF4A3蛋白的作用模式及具体结合位置,同步也富集是否存在内源性间接调控机制,例如ce RNA吸附相关的micro RNA,该研究结果旨在揭示LncRNA SNHG8和eIF4A3蛋白之间的调控机制或作用模式,最终为结直肠癌临床个体化诊治和挖掘新靶标和新型调控途径提供新构思。方法:（1）生物信息学预测与评估:利用RNAfolder生物信息在线平台,针对LncRNA SNHG8的FASTA格式一级核苷酸序列,进行二级序列及构象折叠及自由能的评估;利用STRING在线平台查找eIF4A3蛋白的关键蛋白结构域。利用cat RAPID在线平台预测了两者的直接互作强度和作用元件。（2）结直肠癌细胞内分布与定位检测:采用原位杂交结合免疫荧光方法检测LncRNA SNHG8、eIF4A3蛋白在结直肠癌细胞中的表达、分布及共定位情况。（3）细胞翻译活性抑制实验:细胞给予放线菌酮CHX（200μg/m L）处理后,在不同时间点收集蛋白后,检测随着时间轴的推移（0、0.5、1、2、3、4小时）,沉默LncRNA SNHG8对eIF4A3蛋白翻译的影响及蛋白表达改变情况。（4）Western Blot方法考察在SW620和HCT116细胞株中干预eIF4A3表达后,下游影响细胞凋亡关键蛋白m TOR、细胞生长关键分子EGFR表达水平的变化。（5）细胞克隆形成（CFA）实验检测细胞增殖能力:在SW620和HCT116细胞中沉默或过表达eIF4A3后,对比分析其对上述细胞增殖、克隆形成能力的影响。（6）Ed U（5-Ethynyl-2’-deoxyuridine,胸腺嘧啶核苷类似物）法检测细胞增殖能力变化:在SW620和HCT116细胞株中沉默eIF4A3表达后,比较分析上述细胞DNA复制活性,考察结直肠癌细胞增殖活性的改变。（7）划痕修复实验考察细胞迁移能力的变化:在SW620和HCT116细胞中沉默或过表达eIF4A3后,对比考察其对上述细胞迁移速率和能力的影响。（8）RNA pull-down实验:采用RNA pull-down实验鉴定LncRNA SNHG8直接结合eIF4A3蛋白的作用,并找到靶向识别eIF4A3蛋白的关键序列以及作用位置。（9）LncRNA SNHG8调控eIF4A3 m RNA的ce RNA机制评估:利用ENCORI理论预测和富集LncRNA SNHG8和eIF4A3 m RNA之间可能存在互作micro RNAs,通过双荧光素酶报告基因分析LncRNA SNHG8是否被特异性调控即转录活性变化。（10）荷瘤鼠移植瘤体内验证:建立裸鼠皮下移植瘤模型,跟踪移植瘤生长情况,绘制移植瘤生长、瘤重量、瘤体积的变化曲线;观察荷瘤鼠的生存期。q RT-PCR法检测瘤组织中LncRNA SNHG8、eIF4A3 m RNA表达水平变化。（11）数据分析:本研究采用SPSS19.0软件进行生物学统计比较与分析。分析连续变量时,组间比较采用t检验或单因素方差分析（One-Way ANOVA）,文中数据采用均值±标准差（Mean±SD）表示;分析非连续变量时,采用卡方检验。本研究设定P＜0.05时:表示具有显著性的统计学差异。结果:（1）基于LncRNA SNHG8靶向结合eIF4A3蛋白的假说,我们利用RNAfolder生物信息在线平台进行二级序列及构象折叠自由能的评估,结果发现LncRNA SNHG8最小自由能MFE为-179.30kcal/mol。STRING在线平台确认eIF4A3蛋白的关键结构域主要包括DEXDc和HELICc功能区,进一步利用cat RAPID预测两者的直接互作强度和作用元件GAUGA,提示两者具有直接结合的序列和结构基础。（2）RNA pull-down实验验证发现LncRNA SNHG8-WT探针能够靶向拖拽和富集到eIF4A3蛋白,而突变型探针LncRNA SNHG8-Mut与阴性对照一样,几乎不能富集到eIF4A3,提示LncRNA SNHG8 GAUGA基序是靶向识别eIF4A3蛋白的关键序列。（3）蛋白翻译抑制实验中,在细胞给予CHX处理并沉默LncRNA SNHG8后,考察eIF4A3蛋白翻译水平变化;结果发现沉默LncRNA SNHG8处理组并给予CHX后的2、3、4小时eIF4A3表达量显著降低（P＜0.05）;以上提示两者结合后LncRNA SNHG8能提升eIF4A3蛋白水平,沉默LncRNA SNHG8后则能显著抑制其翻译水平及效率。（4）在SW620和HCT116细胞株中沉默eIF4A3后,下游相关因子m TOR和EGFR蛋白表达水平明显降低（P＜0.0001）。相反,在上述细胞中过表达eIF4A3能显著提升上述细胞株中m TOR和EGFR蛋白的表达水平（P＜0.0001）。（5）在SW620和HCT116细胞株中沉默eIF4A3表达后,结直肠癌细胞的增殖活性及克隆形成能力明显降低（P＜0.0001）。相反地,过表达eIF4A3则能显著提升上述细胞的增殖与克隆形成能力（P＜0.0001）。（6）在SW620和HCT116细胞株中沉默eIF4A3表达后,细胞的增殖活性明显降低;相对应地,在上述细胞中过表达eIF4A3后,则能显著提升上述细胞中Edu掺入,进而提升细胞DNA的增殖活性。（7）划痕修复实验结果发现沉默eIF4A3表达处理后,SW620和HCT116细胞的迁移能力变弱;相反地,在上述细胞中过表达eIF4A3后,则上述细胞的迁移能力显著增强。（8）基于ce RNA学说,利用ENCORI理论预测和富集LncRNA SNHG8和eIF4A3m RNA具有直接结合和互作的潜在靶标分子mi R411-5p。同步根据双荧光素酶报告基因结果,我们发现给予mi R411-5p处理后,LncRNA SNHG8质粒和突变结合序列质粒与空载体质粒对照组之间并无统计学差异（P＞0.05）;目前结果并未发现mi R411-5p可被LncRNA SNHG8特异性调控其转录活性与表达。（9）裸鼠移植瘤模型体内验证LncRNA SNHG8通过eIF4A3促进结直肠癌增殖:裸鼠皮下注射SW620细胞后,发现过表达eIF4A3能明显促进过表达LncRNA SNHG8组的移植瘤体积及瘤重变化,且该组裸鼠生存期明显较LncRNA SNHG8组和LncRNA SNHG8+eIF4A3结合位置突变组的缩短,该结果在体内验证LncRNA SNHG8通过eIF4A3促进裸鼠移植瘤的生长与增殖。结论:（1）在阐明介导结直肠癌增殖等特性与机制层面:我们挖掘并找到LncRNA SNHG8存在特异识别eIF4A3蛋白的关键作用元件GAUGA;两者特异结合可促进eIF4A3蛋白的稳定性;进而上调下游因子如m TOR、EGFR等表达。同时,通过实验验证排除了两者存在ce RNA间接调控机制。因此,本研究基于转录后层面阐释LncRNA SNHG8靶向稳定eIF4A3蛋白介导结直肠癌细胞特性的新机制,为药物研发提供了新靶标和临床诊治的新途径。（2）在体内裸鼠移植瘤模型验证层面:采用荷瘤鼠移植瘤模型验证到LncRNA SNHG8可通过调控eIF4A3表达促进移植瘤增殖速度、瘤体积及瘤重的变化。更为重要的是LncRNA SNHG8和eIF4A3联合干预可显著缩短裸鼠生存时间,以上通过在体实验证实了LncRNA SNHG8靶向调控eIF4A3蛋白促进移植瘤增殖与预后。