广州白纹伊蚊沃尔巴克氏体感染调查分析及感染登革病毒媒介能力研究

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目的:调查广州市九个不同区域的白纹伊蚊种群中沃尔巴克氏体(Wolbachia)的感染情况,基于Wolbachia表面蛋白基因(Wolbachia Surface Protein,wsp)和多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)探讨广州市不同地区白纹伊蚊种群感染的Wolbachia的系统发育关系。于气候箱中模拟夏季和冬季野外环境中温度、湿度和光照强度的变化,比较白纹伊蚊对登革病毒的易感性和传播能力,探究白纹伊蚊对登革病毒媒介能力的影响因素,为蚊媒病的防控工作提供依据。方法:本实验于2020年7~12月采集了广州市的9个白纹伊蚊种群,扩增 Wolbachia 的wsp 基因和 5 个管家基因(gatB、hcpA、ftsZ、coxA、fbpA),扩增产物进行电泳染色检测后送公司测序。得到wsp基因序列后,利用MEGA 7软件分析碱基组成和构建系统发育树(NJ法),DNAsp 6.12软件进行错配分布分析,Arlequin 3.5软件进行中性检验,PopART 1.7软件构建单倍型网络图(Median joining法)。5个管家基因(gatB、hcpA、ftsZ、coxA、fbpA)的序列于PubMLST数据库中比对后确定Wolbachia的ST分型。口饲感染登革病毒的白纹伊蚊置于模拟了广州夏季野外环境、冬季野外环境和标准实验室环境的人工气候箱中饲养,RT-qPCR检测感染第7天、14天蚊虫中肠、卵巢和头部的感染率和病毒载量,同时检测白蚊伊蚊中肠中Dicer-2基因和Rel-1基因的表达量,对比携带Wolbachia与未携带Wolbachia的白纹伊蚊中肠的感染率和病毒载量。结果:广州市9个不同区域的白纹伊蚊种群中Wolbachia感染率都在90%以上。Wolbachia的wsp基因在广州市9个不同区域的白纹伊蚊种群中共检出8个单倍型,其中Hap2为所有种群共享;广州市白纹伊蚊种群中Wolbachia的ST分型主要是2型、464型和465型。Wolbachia的wsp基因在全球8个白纹伊蚊种群中共检出25个单倍型,其中Hap2为所有种群共享;基于wsp基因对Wolbachia种群进行遗传结构分析:中性检验结果显示全球8个种群D值和F值均为负值,错配分布结果显示除澳大利亚和尼日利亚外其他种群均为单峰分布,两两种群间的基因流值(Nm)均>1,种群分化系数值(Fst)在-0.15~0.16之间。感染登革病毒第7天时卵巢和头部的感染率在模拟野外条件下比实验室条件下高;实验室环境下卵巢和头部感染率在第7天比第14天低;感染第7天时中肠的感染率在夏季比冬季高。登革病毒载量和免疫基因Dicer-2表达量存在中度相关关系且相关性具有显著性,所以随着登革病毒载量的增加,免疫基因Dicer-2表达量有减少的趋势。携带Wolbachia的白纹伊蚊中肠的感染率都是低于未携带Wolbachia的,且携带Wolbachia的白纹伊蚊的中肠病毒RNA拷贝数的均值是低于未携带Wolbachia 的。结论:广州9个地区的白纹伊蚊种群中Wolbachia的wsp基因共检出8个单倍型,Hap2被全部8个种群所共享,为优势单倍型,其他单倍型则可能从Hap2演化而来。广州市9个不同区域的白纹伊蚊种群感染的Wolbachia间基因交流频繁,不存在地理隔离现象。广州市白纹伊蚊种群中Wolbachia的ST分型主要是2型、464型和465型,未发现新的ST分型。临近亚洲国家与广州、成都等国内Wolbachia种群间基因交流频繁,这可能与地理位置有关。模拟夏季与冬季野外环境条件(温度、湿度和光照强度)下的白纹伊蚊,在感染DENV-Ⅱ后,显示不同实验条件下或者不同季节白纹伊蚊各组织感染率、传播率有所不同。低温条件下免疫相关基因的表达上调导致白纹伊蚊组织内登革病毒含量降低,且Wolbachia对登革病毒-Ⅱ有抑制作用。
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