论文部分内容阅读
目的观察细颗粒物(fine particulate matter,PM2.5)暴露对小鼠认知功能及肠道菌群组成的影响,探讨肠道菌群及微生物-肠-脑轴在大气PM2.5暴露致小鼠认知功能损伤中的作用。研究结果为今后预防和治疗大气PM2.5暴露所致神经认知功能障碍提供新的思路。方法选择48只健康成年SPF级雄性C57BL/6J小鼠,1 w的适应性喂养后,以每组12只随机分为对照组（NS组）、鼠李糖乳杆菌组（LGG组）、PM2.5暴露组（PM组）和PM2.5+鼠李糖乳杆菌组（PML组）。NS组和PM组每日根据体重灌胃生理盐水,LGG组和PML组灌胃鼠李糖乳杆菌（每10 g体重0.1 mL）,菌悬液浓度1×10~9 CFU/mL。灌胃结束后采用PM2.5在线浓缩富集系统和小动物全身动态暴露系统对PM组和PML组小鼠进行PM2.5染毒,染毒浓度设为室外浓度的8倍,每天6 h,每周6 d,持续染毒7 w。染毒结束后用旷场试验、高架十字迷宫实验和新物体识别实验评价小鼠认知功能;16s r RNA高通量测序技术检测小鼠粪便肠道菌群多样性、组成及丰度变化;光镜和电镜观察小鼠结肠和海马组织结构变化;Western-blot法检测小鼠结肠和海马组织紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin 1的蛋白表达;ELISA法检测小鼠血清和海马组织中神经递质5-羟色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）和γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid,GABA）水平及炎症相关因子脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）含量;气相色谱-质谱联用定量分析小鼠粪便中短链脂肪酸含量;Spearman相关分析小鼠肠道菌群与神经行为指标的相关关系。结果1染毒期间,洁净室、室外和染毒柜的PM2.5浓度分别为11.5（6.0,15.8）μg.m-3、50.2（36.0,66.1）μg.m-3和407.8（294.9,545.4）μg.m-3。2旷场实验中,与NS组相比,PM及PML组小鼠运动总距离减少,PM组中央区停留时间减少（P＜0.05）。高架十字迷宫实验中,与NS组相比,PM组开臂进入次数百分比减少（P＜0.05）;与PM组相比,PML组开臂进入次数百分比增加（P＜0.05）。新物体识别实验中,与NS组相比,PM及PML组小鼠识别指数减少（P＜0.05）;与PM组相比,PML组小鼠识别指数增加（P＜0.05）。3与NS组相比,PM组小鼠肠道菌群α多样性指数simpson和shannon指数升高,β多样性指数下降（P＜0.05）;与PM组相比,PML组simpson和shannon指数下降,β多样性指数升高（P＜0.05）。差异物种分析显示,与NS组相比,PM组乳酸菌属丰度降低,杜氏杆菌属和粪杆菌属丰度升高;与PM组相比,PML组杆菌属丰度降低,卟啉菌属和奈瑟菌属丰度升高（P＜0.05）。LEf Se组间差异物种分析显示PM组的优势物种为杜氏菌属和丹毒丝菌科。4光镜下可见NS组和LGG组小鼠结肠组织形态结构清晰完整,黏膜表面光滑;PM组结肠组织黏膜结构不完整,腺体结构破坏,柱状细胞和杯状细胞数量减少,大量炎性细胞浸润;PML组出现炎性细胞浸润。小鼠海马组织CA1区病理切片显示,NS组和LGG组细胞排列紧密有序,形态规则;PM组细胞排列紊乱,部分细胞核固缩;PML组细胞排列较PM组显著改善。电镜下,NS和LGG组海马神经元细胞结构基本正常,细胞器数量丰富;PM组线粒体明显肿胀和空泡化;PML组超微结构较PM组相比显著改善。5与NS组相比,PM组小鼠结肠和海马组织ZO-1和Occludin蛋白表达水平降低（P＜0.05）;与PM组相比,PML组ZO-1和Occludin蛋白表达水平升高（P＜0.05）。6与NS组相比,PM组海马组织中5-HT水平降低,LGG组和PML组血清GABA水平降低（P＜0.05）;与PM组相比,PML组血清GABA水平降低（P＜0.05）。7与NS组相比,PM组血清和海马组织中LPS和TNF-α水平升高,PML组血清TNF-α水平升高（P＜0.05）;与PM组相比,PML组海马组织中的LPS水平降低,血清和海马组织中的TNF-α水平降低（P＜0.05）。8与NS组相比,PM组和PML组的己酸水平显著降低。9属水平上,PM组优势菌属粪杆菌属与小鼠识别指数、开臂进入次数百分比和5-HT水平呈负相关,而与LPS水平呈正相关;杜氏杆菌属与小鼠识别指数、开臂进入次数百分比和GABA水平呈负相关。结论1 PM2.5暴露导致小鼠认知功能障碍及肠道菌群失衡。2 PM2.5暴露损害小鼠结肠和海马组织结构及内皮紧密连接。3 PM2.5暴露导致小鼠认知功能相关神经递质5-HT失衡,内毒素及炎症因子水平升高,肠道菌群代谢产物己酸水平降低。4 PM2.5暴露后杜氏杆菌属和粪杆菌属细菌丰度升高,与小鼠认知功能呈负相关关系。5PM2.5暴露小鼠添加鼠李糖乳杆菌后,认知功能、组织病理损伤、肠上皮屏障、血脑屏障及相关炎症指标得以改善。研究结果提示PM2.5对中枢神经系统的影响部分源于其造成肠道菌群失调,引起神经化学递质失调和炎症,微生物-肠-脑轴在这一过程中起着重要作用。图19幅;表13个;参114篇。