VEGFR-3通过MEK/ERK信号通路调控矽肺模型中淋巴管生成的机制研究

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目的观察血管内皮生长因子受体-3(vascular endothelial growth factor receptor-3,VEGFR-3)与MEK/ERK信号通路因子在矽肺大鼠模型中的表达趋势,并验证VEGFR-3在人淋巴内皮细胞(human lymphatic endothelial cells,HLECs)上可以通过MEK/ERK信号通路调控淋巴管状结构形成的作用机制。方法选择SPF级成年雄性SD大鼠20只,饲养一周后采用非气管暴露法悬浊液管腔滴注的方式建立大鼠矽肺模型。实验大鼠随机分为四组,每组5只,分别为对照组,模型1w组,模型2w组和模型4w组。三个模型组均气管内滴注Si O2粉尘悬浊液,对照组滴注等量的生理盐水。模型建立一定时间后取肺组织标本,肉眼观察肺组织形态,通过HE染色观察肺组织结构、肺泡完整性及肺间隔厚度等病变情况;天狼猩红染色观察肺组织胶原纤维形成情况;免疫印迹法检测VEGFR-3、p-MEK、p-ERK等主要因子的表达情况。体外培养HLECs,分为六组,分别为对照组,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)-C处理组,VEGF-C+VEGFR-3抑制剂(SAR131675)组,SAR131675(SAR)组,VEGF-C+MEK抑制剂(Selumetinib)组,Selumetinib(Selu)组。通过MTS增殖实验检测HLECs的增殖能力,细胞划痕实验检测HLECs的迁移能力。基质胶管状结构形成实验检测各组别HLECs形成管状结构的能力。免疫印迹法检测VEGFR-3、p-MEK、p-ERK等主要因子的表达情况。结果1体内实验显示与对照组比较,模型组大鼠肺组织体积略微增大,或出现轻微水肿,质地较硬。HE、天狼猩红染色发现,随着造模时间的延长,模型组肺组织结构破坏愈加严重,肺间隔增厚,且有大量炎性细胞浸润,有细胞团状结节生成。2免疫印迹结果显示VEGFR-3、p-MEK、p-ERK的表达在第2w、4w时明显高于对照组(P<0.05)。3体外实验中,通过MTS增殖实验和划痕愈合实验发现VEGF-C(VEGFR-3)可以促进细胞的增殖(P<0.05)和迁移。4免疫印迹结果显示VEGF-C重组蛋白单独刺激可以增加VEGFR-3、p-MEK、p-ERK、LYVE-1的表达;联合使用VEGFR-3抑制剂SAR后,各组因子表达仍略高于对照组,但低于VEGF-C组;联合使用MEK抑制剂Selu后,VEGFR-3表达略低于VEGF-C组(P<0.05)。4管状结构形成实验结果显示,VEGF-C重组蛋白处理组细胞间交叉点数、管腔形成数量及管腔面积明显多于对照组,形成管状结构的能力较强;联合使用SAR后,细胞间交叉点数、管腔形成数量及管腔面积明显少于VEGF-C处理组;联合使用Selu后,细胞间交叉点数、管腔形成数量及管腔面积明显少于VEGF-C处理组,但Selu对细胞间连接的抑制能力弱于SAR(P<0.05)。结论1体内实验中随模型建立时间的延长肺组织结构破坏愈加严重,VEGFR-3、p-MEK、p-ERK的表达升高且呈相同趋势增加;2 VEGF-C重组蛋白及受体VEGFR-3可以促进细胞的增殖和迁移以及p-MEK、p-ERK、LYVE-1的表达,促进HLECs管状结构的形成,在联合使用SAR和Selu后不同程度的抑制因子表达以及管状结构的形成,且SAR对LEC的抑制作用强于Selu。3 VEGFR-3可以通过下游信号通路MEK/ERK调控矽肺模型中淋巴管状结构的形成。图7幅;表5个;参108篇。
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