【摘 要】
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蔗糖酶-异麦芽糖酶（sucrase-isomaltase,SI）是一种能将低聚糖和多糖水解成单糖,并加速二者被吸收进入血液循环,存在于小肠绒毛黏膜表面的α-葡萄糖苷酶。其主要应用于α-葡萄糖苷酶抑制剂的研发,且在医学诊断与治疗等领域有着广泛的应用。目前SI的研究报道主要集中于动物方面,而关于真菌来源SI的报道较少。因平菇中SI的含量丰富并且活性高,所以本研究以其为研究对象,进行异源表达及定点突变,
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蔗糖酶-异麦芽糖酶（sucrase-isomaltase,SI）是一种能将低聚糖和多糖水解成单糖,并加速二者被吸收进入血液循环,存在于小肠绒毛黏膜表面的α-葡萄糖苷酶。其主要应用于α-葡萄糖苷酶抑制剂的研发,且在医学诊断与治疗等领域有着广泛的应用。目前SI的研究报道主要集中于动物方面,而关于真菌来源SI的报道较少。因平菇中SI的含量丰富并且活性高,所以本研究以其为研究对象,进行异源表达及定点突变,探讨SI的作用机制,为α-葡萄糖苷酶抑制剂的研发提供理论依据。本文对平菇中的SI进行克隆表达和分离纯化,并对其酶学性质进行表征。此外,还结合生物信息学技术手段,确定重要氨基酸残基位点,通过定点突变,获得突变体并进行酶学性质表征,以期探究其对酶活力的影响。实验方法:通过PCR完成SI基因的扩增,构建重组质粒p ET-15b-SI,并在E.coli BL21中进行诱导表达,经过分离纯化获得重组蛋白,进行性质表征。利用生物信息学方法进行同源模建及底物对接分析,确定底物结合的关键残基位点,结合同源序列比对结果,选取底物结合的关键残基位点并对其进行定点突变。通过全质粒PCR筛选得到突变体,对突变体诱导表达、分离纯化和酶学性质分析,并将野生型和突变型的酶学性质进行比较,确定重要氨基酸残基位点,探讨其对酶活性的影响。实验结果如下:（1）通过NCBI数据库获取平菇的蔗糖酶-异麦芽糖酶基因（Gen Bank:XM＿036771776.1）序列,设计引物后通过PCR扩增目的基因,经过双酶切与质粒相连接,构建成功并得到了重组质粒p ET-15b-SI,转化到大肠杆菌BL21中,经过16℃,220 rpm下高效诱导表达,通过Ni-NTA柱进行亲和层析获得高纯度的目标蛋白,SDS-PAGE表明分子量在110 k Da左右。（2）野生型性质表征:野生型最适p H为6.0,最适温度为60℃。一价金属离子对SI有明显的激活作用,在10 m M浓度时激活作用最明显;除Mg2+在浓度增大时由激活作用转变为抑制作用,其他金属离子,如Cu2+、Al3+与Fe3+随浓度增加而激活效果更好。大多数的有机溶剂对SI来说都是激活剂,随着浓度增高激活效果增强,其中DMSO的激活作用最明显,而乙醇与丙三醇的激活作用则随着浓度增加而降低。以p NPG为底物,野生型SI动力学曲线符合米氏方程,其Km和Vmax分别为1.63 m M与6.53μmol/ml/min。（3）关键残基位点的确定:利用生物信息学的方法,通过同源模建,构建蔗糖酶-异麦芽糖酶的三维结构。通过与底物p NPG对接,发现D271位点通过氢键与底物结合,同源序列比对发现D271位点在家族中是绝对保守位点,因而选择第271位点氨基酸残基进行定点突变。通过全质粒PCR获得突变体D271A。（4）突变体性质表征:突变体D271A的最适p H为9.0,最适温度为75℃。一价、二价金属离子对D271A基本不呈现激活作用,三价金属离子中Al3+随着浓度增加呈现出较弱的抑制作用,而Fe3+则出现了明显的激活作用。大多数有机溶剂对突变体D271A的活力基本无影响,甲醇在高浓度时有较弱的抑制作用,DMSO则在所有浓度中都呈现出抑制作用,乙醇与丙三醇随着浓度增加由抑制剂变为了激活剂。突变体D271A以p NPG为底物,其动力学曲线符合米氏方程,Km和Vmax分别为2.18 m M和1.59μmol/ml/min。同野生型相比,突变体的Km比野生型大,说明突变体对p NPG的亲和力比野生型低,很可能是因为突变体与底物结合时氢键数目减少,与底物结合的不牢固,而新的空间构象不利于酶对底物的亲核进攻,从而导致野生型Vmax是突变体的4.1倍。
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