背根神经节（Dorsal root ganglion,DRG）神经元是躯体初级感觉神经元,是感觉的形成和传递通路的重要组分。DRG神经元表达多种重要的功能分子,在整个感觉传递及调控过程中扮演着重要的角色。本论文的第一部分将主要探讨DRG神经元内DWSA7蛋白对外周机械刺激信号传递的影响;第二部分将主要探讨DRG局部GABA能回路中的α5-GABAA受体亚型在神经病理性疼痛中的改变和贡献。第一部分 DRG神经元中DWSA7蛋白对外周机械刺激感觉传递的影响DWSA蛋白家族是一组跨膜离子通道样蛋白基因家族,具有多个跨膜区域,包括8个成员DWSA1-DWSA8。根据基因同源性又可进一步分为3个亚家族,如DWSA1-DWSA3属于A亚家族,DWSA5和DWSA6属于B亚家族,DWSA4、DWSA7和DWSA8属于C亚家族。由于DWSA家族本身的一些特性,一直以来人们对DWSA家族的功能了解不很清楚,这也使得对DWSA家族功能的研究成为当前科学研究的一大热点。DWSA1是该家族最被广泛研究的成员之一,有研究表明DWSA1本身可能具有离子通道的功能,但也有研究对此结果表示怀疑。而对DWSA家族其他成员的功能研究的报道则更是少之又少。我们的初步试验发现该家族成员之一 DWSA7蛋白在外周DRG神经节神经元中具有较高水平的表达,推测该处的DWSA7蛋白有可能与感觉神经元感受外界环境的刺激有关,因此本部分内容为证明此推测进行了多方面的实验。这一研究将进一步增进对DWSA家族功能的了解,同时也将增加对外周感觉调控的认识。目的:研究DWSA7蛋白敲除对大鼠机械刺激行为学的影响;探究DWSA7蛋白敲除对大鼠DRG神经元机械敏感电流（RA,IA,SA）的影响;探讨DWSA7蛋白对Piezo2通道的调节作用。方法:1.行为学实验方法:应用Von Frey纤维针和热刺痛仪测定大鼠机械阈值、热痛阈值;2.DRG神经元病毒敲减或过表达技术;3.免疫组织化学技术和qPCR技术;4.“Mechano-clamp”电生理膜片钳技术;5.Western blot蛋白定量技术及免疫共沉淀技术。结果:1 DWSA7对大鼠感觉行为的影响1.1 DWSA7敲除大鼠行为学实验结果通过Von Frey纤维实验观测到DWSA7敲除雄性大鼠对机械刺激的反应阈值为（11.18±1.20 g）,较同窝对照雄性WT大鼠（14.50±0.50 g）相比显著降低（two samples t test,*P<0.05）,而热痛阈值无变化;同样DWSA7敲除雌性大鼠对机械刺激的反应阈值为（10.56±1.02 g）,较同窝对照雌性WT大鼠（14.22±0.53 g）相比显著降低（two samples t test,*P<0.05）,而热痛阈值有所增加（two samples t test,*P<0.05）。1.2 DRG局部注射腺相关病毒行为学实验结果于雄性大鼠DRG局部注射AAV5-DWSA7shRNA-GFP,其机械阈值为（3.13±0.75 g）,较对照病毒注射组（7.75±1.93 g）相比明显降低（Two-sample t test,*P<0.05）,而热痛阈值无变化;在DRG局部注射 AAV5-DWSA7mRNA-GFP,其机械刺激阈值（13.42±1.86 g）较对照病毒注射组（7.75±1.93 g）相比显著升高（Two-sample t test,*P<0.05）,热痛阈值无变化。以上结果说明DWSA7敲除可明显增加大鼠对机械刺激的敏感性。2 DWSA7蛋白对DRG神经元电生理特性的影响2.1 DWSA7蛋白对DRG神经元胞体的膜电活动的影响结果:通过电生理学实验对体外培养的DWSA7敲除大鼠和同窝对照WT大鼠的DRG神经元进行打孔膜片钳记录,其实验结果显示,DWSA7敲除大鼠和同窝对照WT大鼠的DRG神经元生理状态下的静息膜电位、神经元动作电位（AP）及兴奋性无区别,由此可见,DWSA7蛋白并不是通过改变DRG的静息膜电位和电导来影响外周感觉信号的传递过程。2.2“Mechano-clamp”电生理实验方法分别记录同窝对照WT和DWSA7敲除大鼠DRG神经元的机械敏感电流:与WT大鼠的DRG神经元快速适应性（RA）机械敏感电流的细胞数目比例（45/91,49.45%）相比,DWSA7敲除大鼠的DRG神经元RA机械敏感电流的细胞数目比例上升（32/54,59.26%）,但两组间机械敏感电流的比例无统计学差异（Pearson Chi-Square,x 2=2.09,P>0.05）,但其失活常数显著减少（Mann-Whitney test,*P<0.05）。2.3 慢病毒敲减DRG神经元内DWSA7的机械敏感电流:与对照组DRG神经元RA机械敏感电流的细胞数目比例（感染scramble慢病毒27/52,51.92%）相比,BLV-DWSA7shRNA-GFP干扰的DRG神经元RA机械敏感电流的细胞数目比例增加（31/48,64.58%）,但两组间无统计学差异（Pearson Chi-Square,x 2=1.787,P>0.05）其失活常数无显著差异。2.4 在DWSA7-KO大鼠的DRG神经元内慢病毒过表达DWSA7的机械敏感电流:与DWSA7-KO大鼠的DRG神经元RA机械敏感电流的细胞数目比例（32/54,59.26%）相比,DWSA7-KO大鼠的DRG神经元经BLV-DWSA7mRNA-GFP感染后,其RA机械敏感电流的细胞数目比例显著降低（8/36,22.22%）,具有明显的组间差异（Pearson Chi-Square,x2=19.695,***P<0.001）,且其失活常数显著增加（Mann-Whitneytest,**P<0.01）。以上结果提示DWSA7蛋白对DRG神经元内的RA机械敏感电流有重要调节作用,而已知Piezo2是介导DRG神经元内RA机械敏感电流的重要通道,故本部分的后续实验主要研究DWSA7对Piezo2通道的调节作用。3 DWSA7蛋白对Piezo2通道的调节作用3.1 DWSA7蛋白对DRG神经元中Piezo2表达的影响3.1.1 DWSA7蛋白不影响DRG神经元Piezo2的表达:通过免疫荧光的方法,观察到Piezo2在DWSA7敲除大鼠DRG神经元中和同窝对照WT大鼠DRG神经元中均有较高水平的免疫反应,但无统计学差异;通过western蛋白定量的方法,DWSA7敲除大鼠和同窝对照WT大鼠DRG组织中Piezo2的蛋白水平无显著差异;同样通过实时定量PCR的方法,DWSA7敲除大鼠和同窝对照WT大鼠DRG组织中Piezo2的mRNA水平无差异。以上结果说明DWSA7敲除不影响大鼠DRG神经元内Piezo2通道的表达。3.1.2 DWSA7不影响外源系统中Piezo2的表达:RT-qPCR结果表明,在共转染DWSA7+Piezo2和单独Piezo2质粒的HEK293T细胞中Piezo2 mRNA表达无差异;Western blot蛋白定量结果表明,在共转染DWSA7+Piezo2、DWSA1+Piezo2 和单独Piezo2 质粒的 HEK293T 细胞中,Piezo2蛋白的全细胞蛋白和膜蛋白表达均无明显区别。然而,我们在Western blot实验中观察到HEK293T细胞中有较强的内源性Piezo2通道条带,目前我们还不能排除所用抗体存在特异性差的可能性。3.2 DWSA7蛋白对Piezo2通道功能的影响HEK293A细胞的“Mechano-clamp”结果:单独转染Piezo2的HEK293A细胞均可记录到RA机械敏感电流（n=8,100%）。我们在HEK293A 细胞中同时转染 Piezo2+DWSA7 或 Piezo2+DWSA1（对照）。3.2.1 共转染Piezo2+DWSA1的HEK293A细胞仍可以介导RA机械敏感电流（n=10,100%）,而共转染 Piezo2+DWSA7 的 HEK293A 细胞的机械敏感电流的数目明显下降,其中介导RA机械敏感电流的HEK293A细胞数目比例为2/18,介导中间适应性（IA）机械敏感电流的HEK293A细胞数目比例为4/18,介导慢适应性（SA）机械敏感电流的HEK293A细胞数目比例为4/18,没有反应的HEK293A细胞数目比例为8/18。3.2.2 表达有Piezo2+DWSA7的HEK293A细胞的实验组与对照相比（表达有Piezo2+DWSA1的HEK293A细胞）,其机械敏感电流幅度显著降低且具有明显的组间差异（Repeated measures ANOVA,F（1,14）=10.938,##P<0.01）。3.2.3 与对照组（共转染Piezo2+DWSA1）HEK293A细胞介导RA机械敏感电流的失活常数（midian=4.96）相比,转染Piezo2+DWSA7的HEK293A细胞介导的机械敏感电流的失活常数显著增加（midian=23.27,Mann-Whitney test,***P<0.001）。这些结果提示 DWSA7 蛋白抑制 Piezo2通道介导的RA机械敏感性电流的产生,并促进其向IA或SA机械敏感性电流转化。3.3 DWSA7蛋白与Piezo2通道的相互作用在 HEK293A 细胞中共转染 Piezo2+DWSA7-MYC-DDK,使用MYC抗体进行对Piezo2通道进行免疫共沉淀,通过western的方法并未检测到piezo2的条带。此结果提示DWSA7蛋白与piezo2不存在直接的相互作用。结论:1.DWSA7敲除可明显增加大鼠对机械刺激的敏感性;DWSA7蛋白的敲除不影响DRG神经元生理状态下的静息膜电位、动作电位及兴奋性。2.DWSA7蛋白不影响Piezo通道的表达;但可显著降低HEK293A内表达Piezo2介导的RA机械敏感电流的比例、幅度,并使其向IA或SA转化;3.DWSA7对Piezo2通道的调节可能不是直接的相互作用。第二部分 DRG神经元中α5-GABAA受体亚型与大鼠慢性疼痛发生的关系GABA是哺乳动物中枢神经系统中的重要抑制性神经递质,其抑制作用主要是通过GABAA受体激活引起Cl-内流产生的膜超极化。脊髓背角的疼痛传递过程中的初级换元部位,也一直被认为是疼痛传递的门控部位,而脊髓背角的GABA抑制性回路是其发挥门控调节的重要基础。而我们前期的研究证明了 DRG局部存在类似脊髓背角的功能性GABA回路,包括多种组分:GABA合成酶（GAD65,GAD67）、GABA转运体（VGAT,GAT1-3）、GABA 受体（GABAA,GABAB）。该系统激活可抑制疼痛信号由外周向中枢神经系统的传递,减轻疼痛行为。这一发现使我们认识到DRG不仅发挥对疼痛信号的传导作用,也具有对疼痛信号调节的作用。因此我们提出DRG是疼痛传递过程中的新“gate”的理论,也提出DRG可以作为疼痛治疗的重要靶点。慢性疼痛是目前疼痛领域的常见难治病症,我们前期的实验证明激活DRG局部GABA回路系统可以减轻动物慢性炎性疼痛和慢性神经病理性疼痛的症状。为了进一步深入研究DRG局部GABA回路系统在慢性疼痛发生发展中的作用,以及其作为慢性疼痛治疗靶点的可能性,我们前期筛查了 DRG局部GABA回路的各个组分在慢性炎性疼痛和慢性神经病理性疼痛的变化,初期结果发现α5-GABAA受体亚型在慢性疼痛过程中显示最为明显的表达变化,因此本部分将重点关注DRG局部α5-GABAA受体亚型在慢性疼痛发生以及治疗中的作用。目的:观察α5-GABAA受体亚型在DRG组织中的表达模式;探讨α5-GABAA受体亚型在慢性疼痛的发生过程中的作用及作为慢性疼痛治疗靶点的意义。方法:1.定量PCR技术;2.冰冻切片免疫荧光技术;3.制备神经病理性疼痛模型CCI和SNI和慢性炎性疼痛模型CFA;4.Von Frey纤维刺痛技术和热辐射刺痛技术;5.DRG局部腺相关病毒注射和渗透泵靶向DRG给药技术。结果:1 α5-GABAA受体亚型在DRG组织中的表达模式通过免疫荧光的方法观察到α5-GABAA受体亚型在大鼠DRG神经元中有高水平表达,且α5-GABAA受体亚型与肽能DRG神经元marker抗钙降素基因相关肽（CGRP）、非肽能DRG神经元marker isolection B4（IB4）以及大直径DRG神经元marker NF200均有明显的共定位情况。2 DRG局部α5-GABAA受体亚型在病理性疼痛发生过程中的表达变化建立CCI和SNI模型,定量PCR结果显示在术后第五天和第十四天,两组模型大鼠α5-GABAA受体亚型的mRNA均显著上调,并具有统计学差异（Two-sample t test,**P<0.01,***P<0.01）。Western blot 结果也进一步验证了在CCI模型大鼠L4-6 DRG组织中α5-GABAA受体亚型蛋白表达的增加。3 在体研究α5-GABAA受体亚型在病理性疼痛发生中的作用3.1 DRG局部敲减α5-GABAA对大鼠基础痛阈的影响:大鼠L5 DRG部位注射AAV5-α5 GABAA shRNA-GFP四周后,大鼠对机械刺激的反应阈值为（10.63±0.93 g）,较对照组相比（注射scramble病毒,7.88±0.86 g）明显增加（Two-sample t test,n=16,*P<0.05）,而热痛阈值无明显变化。3.2 α5-GABAA在大鼠慢性神经病理性疼痛发生中的作用:实验组大鼠L5 DRG注射AAV5-α5GABAA shRNA-GFP腺相关病毒四周后,行CCI术。在术后1,3,5,7,10,14天进行机械刺激和热痛实验的测定,实验结果显示实验组机械刺激阈值和热痛阈值较对照组显著升高,且存在明显的组间差异（repeated measures ANOVA,#P<0.05,post hoc comparisons,*P<0.05）。3.3 α5-GABAA在大鼠慢性炎性疼痛发生中的作用:实验组大鼠L5 DRG注射AAV5-α5GABAA shRNA-GFP腺相关病毒四周后,足底注射CFA。在注射后1,3,5,7,10,14天进行机械刺激和热痛实验的测定,结果显示实验组热痛阈值较对照组显著升高,两组间存在显著差异（repeated measures ANOVA,#P<0.05,post hoc comparisons,*P<0.05）。4 α5-GABAA受体作为慢性疼痛治疗靶点的可能通过渗透泵靶向DRG给药系统对CCI模型大鼠L5 DRG部位持续给予α5-GABAA受体亚型特异性阻断剂L655,708两周,对照组给予空白溶剂,在术后1,3,5,7,10,14天进行机械痛和热痛实验的测定。结果显示L655,708的应用可使术后的机械刺激阈值和热痛阈值显著升高,且均存在明显的组间差异（repeated measures ANOVA,#P<0.05,##P<0.01）。尤其是在L655,708注射后第7,10和14天机械痛阈值显著升高,且具有统计学差异（post hoc t-test comparison,*P<0.05）;在 L655,708 注射后第7和10天热痛阈值显著升高,并具有统计学差异（post hoc t-test comparison,*P<0.05）。结论:1.α5-GABAA受体亚型广泛表达于各类DRG神经元中;2.α5-GABAA受体亚型在慢性神经病理性模型中的表达显著升高;3.α5-GABAA受体亚型参与大鼠的基础机械痛阈的调节;4.α5-GABAA受体在大鼠慢性神经病理性疼痛及慢性炎性疼痛发生过程中发挥重要作用;5.α5-GABAA受体亚型可能为慢性神经病理性疼痛治疗的有效靶点。