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本研究希望通过对人妊娠子宫肌条等长张力的测定初步研究硫化氢和一氧化氮两种气体分子对人足月妊娠不同状态离体子宫平滑肌收缩功能的影响,并通过PCR和免疫组化方法观察ATP敏感性钾通道三种亚基Kir6.1、Kir6.2和SUR2B在人未临产/临产子宫平滑肌的分布表达,了解硫化氢调节子宫收缩的可能作用机制,为预防和治疗早产及其他子宫平滑肌异常收缩相关疾病提供理论依据。第一部分硫化氢对人足月妊娠不同状态子宫平滑肌收缩功能的调节研究目的探讨硫化氢对人足月妊娠不同状态子宫平滑肌收缩功能的调节作用,并进一步研究ATP敏感性钾通道在人未临产/临产子宫平滑肌的表达情况。研究方法1、应用子宫平滑肌组织进行肌条等长张力测定实验,分为四组:A组:非催产素(OT)诱导的足月未临产组(term non-labor, TNL);B组:非OT诱导的足月临产组(term labor, TL);C组:OT诱导的TNL组;D:OT诱导的TL组。方法如下:1.1直接在已建立子宫肌条规律宫缩的浴槽中按浓度递进方式加入硫氢化钠溶液(硫化氢供体)[浓度10-8~10-3mmol/L]。1.2在建立规律宫缩的浴槽中加入KATP阻断剂(格列苯脲) [浓度10-2mol/L],5min后加入硫氢化钠[浓度10-3mol/L],观察记录肌条收缩情况。2、提取子宫平滑肌组织总RNA,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和荧光实时定量PCR(Real-time PCR)分析KATP三种亚基Kir6.1、Kir6.2和SUR2B的mRNA在TL和TNL组子宫平滑肌的表达情况。3、用免疫组化法检测KATP的三种亚基Kir6.1、Kir6.2和SUR2B的蛋白受体在TL和TNL组子宫平滑肌的分布情况。结果(1)在10-8～10-3mol/L的浓度范围内,硫化氢在10-7mol/L时表现出对TL组和TL(OT)组的子宫平滑肌收缩的抑制作用,这种抑制作用表现在收缩波曲线下面积(AUC)的抑制率和收缩频率上,并且呈剂量依赖性,而对收缩张力无明显影响;(2)TL组与TL(OT)组相比,两组间最大AUC抑制率、收缩频率抑制率差别均无统计学意义(P>0.05);(3)计算两组AUC抑制率EC50值分别为80.01±45.21μmol/L、7.31±2.62μmol/L,差异显著(P=0.012)。收缩频率抑制率EC50值分别为42.62±11.03μmol/L、4.75±1.32μmol/L,差异显著(P=0.029),说明催产素诱导产生宫缩的临产子宫肌对硫化氢的敏感性较高;(4)在TNL组和TNL(OT)组中,硫化氢对子宫肌收缩波AUC和收缩频率的抑制率与加入硫氢化钠之前相比无明显差异(P>0.05)。硫化氢对未临产子宫平滑肌产生的宫缩无明显抑制作用;(5)运用KATP通道阻断剂格列苯脲5min后,再加入硫氢化钠,硫化氢对宫缩的抑制作用消失;(6)运用Real-time PCR技术对人未临产/临产子宫平滑肌组织中的KATP通道的三种亚基:Kir6.1、Kir6.2、SUR2B的mRNA进行定量分析,发现:①TNL组中,三种亚基含量依次为:SUR2B>Kir6.2>Kir6.1(P=0.016,0.072),而TL组中三种亚基的含量差别不明显(P>0.05)。②TNL组与TL组相比,SUR2B、Kir6.2的含量高于TL组,其差别具有统计学差异(P=0.045,0.047),而两组间Kir6.1差别无统计学意义(P>0.05)。(7)免疫组化结果显示,Kir6.1、Kir6.2、SUR2B的受体蛋白在TNL组和TL组的子宫平滑肌中均有表达。小结硫化氢对TL组和TL(OT)组的子宫肌的收缩都有抑制作用,并且呈剂量依赖性,催产素诱导的临产子宫肌对硫化氢的敏感性强于自主宫缩组。加入KATP通道阻断剂格列苯脲后,硫化氢抑制宫缩的作用消失,提示了硫化氢可能通过作用于KATP通道,舒张平滑肌细胞,达到抑制宫缩的作用。KATP通道的三种亚基Kir6. 1、Kir6. 2、SUR2B的mRNA在TNL组和TL组的子宫平滑肌上均有表达,其受体蛋白也均有表达,表明人类妊娠子宫平滑肌中存在KATP通道的表达,未临产和临产的子宫平滑肌中SUR2B、Kir6.2的mRNA表达水平不同,提示了SUR2B、Kir6.2水平的改变可能与平滑肌收缩的变化有关。第二部分一氧化氮对人足月妊娠不同状态子宫平滑肌收缩功能的调节研究目的探讨一氧化氮对人足月妊娠不同状态子宫平滑肌收缩功能的调节。研究方法应用子宫平滑肌组织进行肌条等长张力测定,分为四组:A组:非催产素(OT)诱导的足月未临产组(term non-labor, TNL);B组:非OT诱导的足月临产组(term labor, TL);C组:OT诱导的TNL组;D:OT诱导的TL组。方法如下:直接在已建立子宫肌条规律宫缩的浴槽中按浓度递进方式加入硝普钠(一氧化氮供体)溶液[浓度10-8~10-5mol/L],以累加的方式加入浴槽中,观察记录肌条收缩情况。结果(1)在10-8～10-5mol/L的浓度范围内,硝普钠对TNL组和TL组的子宫平滑肌的收缩都表现出抑制作用,并且呈剂量依赖性。主要表现在曲线下面积(AUC)的减少,而对于收缩张力及频率无明显影响;(2)在TNL组中,当浓度达到10-6mol/L的时候,硝普钠表现出对子宫肌条收缩波曲线下面积(AUC)的抑制作用,在10-5mol/L时,对AUC的抑制率与加入硝普钠前相比出现明显差异(P=0.007);(3)在TL组中,当浓度为10-7mol/L时即出现对子宫肌条收缩波曲线下面积(AUC)的抑制作用,浓度达到10-5mol/L时,抑制作用最为明显(P=0.001);(4)在TNL(OT)组和TL(OT)组中,未观察到硝普钠对于催产素诱导产生宫缩的子宫平滑肌收有明显抑制作用;(5)TNL组和TL组的EC50值分别为1.165±0.651μmol/l、0.325±0.102μmol/l,存在统计学差异(P=0.033),说明未临产和临产的子宫平滑肌对于一氧化氮的敏感性存在不同,临产子宫平滑肌对一氧化氮的敏感性上升。小结一氧化氮对TL和TNL组的子宫肌的收缩都具有抑制作用,并且呈剂量依赖性,一氧化氮对TL组的抑制率大于TNL组。临产的子宫平滑肌对一氧化氮的敏感性升高。结论1、硫化氢对TL组和TL(OT)组的子宫肌的收缩都有抑制作用,并且呈剂量依赖性,催产素诱导的临产子宫肌对硫化氢的敏感性似乎强于自主宫缩组。加入KATP通道阻断剂格列苯脲后,硫化氢抑制宫缩的作用消失,提示了硫化氢可能通过作用于KATP通道,舒张平滑肌细胞,达到抑制宫缩的作用。2、KATP通道的三种亚基Kir6. 1、Kir6. 2、SUR2B的mRNA在TL组和TNL组的子宫平滑肌上均有表达,未临产和临产的子宫平滑肌组织中SUR2B、Kir6.2 mRNA的表达含量不同,推测SUR2B、Kir6.2表达含量的改变与子宫平滑肌收缩的变化有关。应用免疫组化在TNL组和TL组均检测到Kir6. 1、Kir6. 2、SUR2B的受体蛋白。3、一氧化氮对TL和TNL组的子宫肌的收缩都具有抑制作用,并且呈剂量依赖性。一氧化氮对TL组的抑制率大于TNL组,临产的子宫平滑肌对一氧化氮的敏感性升高。