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硒化铜纳米粒(Cu2-xSe NPs)是由金属元素铜与硫族元素硒所组成的硫属铜纳米材料，因其较强的近红外(NIR)吸收特性，而被广泛应用于光学诊断和光热疗法等诸多领域。近年来，随着Cu2-xSe NP应用范围的不断扩大，其生物安全性也受到越来越多的关注。已有多种纳米材料被报道可穿透血脑屏障进入中枢神经系统，产生神经毒性，但Cu2-xSe NPs能否进入中枢神经系统，是否具有神经毒性及其神经毒性作用机制尚缺乏研究。本研究采用国际公认的体外神经生物学模型大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤单克隆细胞株（PC-12细胞），发现Cu2-xSe NPs对PC-12细胞具有细胞毒性，且毒性呈现浓度和时间依赖性。进一步的机制研究发现Cu2-xSe NPs可致PC-12细胞线粒体损伤、三磷酸腺苷(ATP)减少，诱导产生氧化性物质活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)和过氧化氢(H2O2)，并抑制抗氧化物质谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶(SOD)的产生。此外，动物实验进一步证实Cu2-xSe NPs可通过影响BALB/c小鼠脑内氧化应激水平，诱导氧化应激作用以及纹状体和海马组织损伤，产生神经系统毒性。综上所述，我们认为Cu2-xSe NPs具有体内外神经毒性，其毒性产生机制主要通过氧化应激作用损伤PC-12细胞和BALB/c小鼠神经系统。
目的：
本研究通过探究Cu2-xSe NPs对PC-12细胞、BALB/c小鼠神经系统的毒副作用，评估其神经毒性；并进一步探讨Cu2-xSe NPs神经毒性的作用机制，为Cu2-xSe NPs更为安全的生物学应用提供毒理学实验基础。
方法：
1．Cu2-xSe NPs的制备与表征
Cu2-xSe NPs的制备采用文献报道的一步合成法，透射电子显微镜观察纳米粒的形态；粒度分析与电位分析仪测定Cu2-xSe NPs在超纯水和生理盐水中的平均水合粒径和Zeta电位，考察纳米粒的粒径分布和稳定性；利用红外光谱仪测定Cu2-xSe NPs的近红外吸收特性；X射线能量散射光谱分析仪(EDS)测定Cu2-xSe NPs元素组成和原子比例。
2．Cu2-xSe NPs对PC-12细胞毒性评价及机制研究
倒置显微镜下观察Cu2-xSe NPs作用后PC-12细胞形态的变化；MTT实验检测不同的Cu2-xSe NPs作用下，PC-12细胞细胞活力的变化；流式细胞术检测给药组细胞调亡情况；透射电子显微镜观察Cu2-xSe NPs对PC-12细胞线粒体形态的影响；化学荧光显色法测定线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential，MMP)、ATP水平的变化，考察Cu2-xSe NPs对线粒体功能的影响；利用试剂盒测定PC-12细胞内ROS水平、H2O2含量、MDA含量、SOD活力、GSH含量的变化，考察细胞内脂质过氧化和抗氧化水平变化与细胞毒性的关系。
3．Cu2-xSe NPs对BALB/c小鼠中枢神经系统毒性效应评价及机制研究
利用BALB/c小鼠成功构建Cu2-xSe NPs体内神经毒性研究模型，随机分为给药组和对照组，给药20天后处死。实验结束时每组随机选择1只小鼠剖取全脑，做常规病理切片，经苏木素-伊红染色后，观察各组小鼠纹状体和海马组织结构的改变；采用TUNEL法和免疫组化caspase-3染色法观察小鼠纹状体和海马组织细胞凋亡情况；其余小鼠迅速剖取新鲜的纹状体和海马神经组织匀浆，利用试剂盒测定纹状体和海马组织中H2O2水平、MDA含量、SOD活力、GSH含量的变化，考察小鼠纹状体和海马组织内脂质过氧化和抗氧化水平变化与Cu2-xSe NPs对BALB/c小鼠中枢神经系统毒性的关系。
结果：
1．本实验所制备的Cu2-xSe NPs，在透射电子显微镜(TEM)视野下呈球形，分散均匀，无团聚现象；动态光散射(Dynamic light scattering，DLS)结果显示使用超纯水和生理盐水分散的Cu2-xSe NPs连续一周水合粒径、Zeta电位均未出现显著变化，表明纳米粒在超纯水和生理盐水中具有良好的分散性和稳定性；经红外光谱仪测定结果显示，所制备的Cu2-xSe NPs在近红外区650到1350nm波长范围内有较强吸收，在1070nm波长处表现出最强吸收；EDS结果表明Cu2-xSe NPs中，铜原子与硒的原子比为1.3∶1(X=0.7)。
2．在不同浓度的Cu2-xSe NPs作用下，梭形PC-12细胞数量逐渐减少，圆形PC-12细胞明显增多，胞间突起连接点减少；MTT实验结果表明，PC-12细胞经过不同浓度的Cu2-xSe NPs作用12h，24h，36h后，纳米粒诱导PC-12细胞活力下降呈现出浓度和时间依赖性；同时，AV/PI双染色后，流式细胞仪检测结果表明，细胞坏死数量也显著增加；TEM结果表明Cu2-xSe NPs进入PC-12细胞后，定位于线粒体，引起线粒体肿胀损伤；MMP水平与ATP含量变化显示Cu2-xSe NPs进入PC-12细胞后，对线粒体功能造成极大损伤；试剂盒检测结果表明，PC-12细胞内ROS、H2O2、MDA水平显著升高，而SOD活力、GSH含量显著下降，表明Cu2-xSe NPs对PC-12细胞毒性与氧化应激作用有关。综合上述实验结果，Cu2-xSe NPs进入PC-12细胞后，可引起细胞内线粒体损伤和氧化应激作用，产生细胞毒性。
3．体内动物实验进一步证实Cu2-xSe NPs的神经毒性作用。小鼠纹状体和海马神经组织切片H&E染色发现细胞密度降低、液化性坏死、炎症细胞浸润和纤维化等现象，而对照组纹状体和海马组织结构正常，未见核固缩和染色质溶解等现象，表明Cu2-xSeNPs可引起BALB/c小鼠纹状体和海马神经组织损伤；与对照组比较，Cu2-xSe NPs处理组小鼠纹状体和海马神经组织切片内TUNEL染色阳性、caspase-3阳性细胞数均显著升高，提示纳米粒诱导神经细胞凋亡和神经毒性；给药组小鼠纹状体和海马神经组织内H2O2、MDA水平的升高和SOD活力、GSH含量的下降，表明Cu2-xSe NPs引起BALB/c小鼠中枢神经系统毒性与氧化应激作用有关。
结论：
1．Cu2-xSe NPs进入PC-12细胞后，定位于线粒体，对其造成损伤，影响细胞内氧化还原平衡体系，进而产生细胞毒性，毒性作用具有浓度和时间依赖性，毒性机制与线粒体损伤和氧化应激作用有关。
2．Cu2-xSe NPs尾静脉注射BALB/c小鼠体内后，对小鼠脑纹状体和海马组织造成损伤，产生神经系统毒性，毒性作用与氧化应激机制有关。
3．综合体内外实验结果，Cu2-xSe NPs具有神经方面毒性，毒性机制与氧化应激作用有关，为Cu2-xSe NPs更加安全广泛的生物学应用提供了毒理学实验基础，研究具有深远意义。
目的：
本研究通过探究Cu2-xSe NPs对PC-12细胞、BALB/c小鼠神经系统的毒副作用，评估其神经毒性；并进一步探讨Cu2-xSe NPs神经毒性的作用机制，为Cu2-xSe NPs更为安全的生物学应用提供毒理学实验基础。
方法：
1．Cu2-xSe NPs的制备与表征
Cu2-xSe NPs的制备采用文献报道的一步合成法，透射电子显微镜观察纳米粒的形态；粒度分析与电位分析仪测定Cu2-xSe NPs在超纯水和生理盐水中的平均水合粒径和Zeta电位，考察纳米粒的粒径分布和稳定性；利用红外光谱仪测定Cu2-xSe NPs的近红外吸收特性；X射线能量散射光谱分析仪(EDS)测定Cu2-xSe NPs元素组成和原子比例。
2．Cu2-xSe NPs对PC-12细胞毒性评价及机制研究
倒置显微镜下观察Cu2-xSe NPs作用后PC-12细胞形态的变化；MTT实验检测不同的Cu2-xSe NPs作用下，PC-12细胞细胞活力的变化；流式细胞术检测给药组细胞调亡情况；透射电子显微镜观察Cu2-xSe NPs对PC-12细胞线粒体形态的影响；化学荧光显色法测定线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential，MMP)、ATP水平的变化，考察Cu2-xSe NPs对线粒体功能的影响；利用试剂盒测定PC-12细胞内ROS水平、H2O2含量、MDA含量、SOD活力、GSH含量的变化，考察细胞内脂质过氧化和抗氧化水平变化与细胞毒性的关系。
3．Cu2-xSe NPs对BALB/c小鼠中枢神经系统毒性效应评价及机制研究
利用BALB/c小鼠成功构建Cu2-xSe NPs体内神经毒性研究模型，随机分为给药组和对照组，给药20天后处死。实验结束时每组随机选择1只小鼠剖取全脑，做常规病理切片，经苏木素-伊红染色后，观察各组小鼠纹状体和海马组织结构的改变；采用TUNEL法和免疫组化caspase-3染色法观察小鼠纹状体和海马组织细胞凋亡情况；其余小鼠迅速剖取新鲜的纹状体和海马神经组织匀浆，利用试剂盒测定纹状体和海马组织中H2O2水平、MDA含量、SOD活力、GSH含量的变化，考察小鼠纹状体和海马组织内脂质过氧化和抗氧化水平变化与Cu2-xSe NPs对BALB/c小鼠中枢神经系统毒性的关系。
结果：
1．本实验所制备的Cu2-xSe NPs，在透射电子显微镜(TEM)视野下呈球形，分散均匀，无团聚现象；动态光散射(Dynamic light scattering，DLS)结果显示使用超纯水和生理盐水分散的Cu2-xSe NPs连续一周水合粒径、Zeta电位均未出现显著变化，表明纳米粒在超纯水和生理盐水中具有良好的分散性和稳定性；经红外光谱仪测定结果显示，所制备的Cu2-xSe NPs在近红外区650到1350nm波长范围内有较强吸收，在1070nm波长处表现出最强吸收；EDS结果表明Cu2-xSe NPs中，铜原子与硒的原子比为1.3∶1(X=0.7)。
2．在不同浓度的Cu2-xSe NPs作用下，梭形PC-12细胞数量逐渐减少，圆形PC-12细胞明显增多，胞间突起连接点减少；MTT实验结果表明，PC-12细胞经过不同浓度的Cu2-xSe NPs作用12h，24h，36h后，纳米粒诱导PC-12细胞活力下降呈现出浓度和时间依赖性；同时，AV/PI双染色后，流式细胞仪检测结果表明，细胞坏死数量也显著增加；TEM结果表明Cu2-xSe NPs进入PC-12细胞后，定位于线粒体，引起线粒体肿胀损伤；MMP水平与ATP含量变化显示Cu2-xSe NPs进入PC-12细胞后，对线粒体功能造成极大损伤；试剂盒检测结果表明，PC-12细胞内ROS、H2O2、MDA水平显著升高，而SOD活力、GSH含量显著下降，表明Cu2-xSe NPs对PC-12细胞毒性与氧化应激作用有关。综合上述实验结果，Cu2-xSe NPs进入PC-12细胞后，可引起细胞内线粒体损伤和氧化应激作用，产生细胞毒性。
3．体内动物实验进一步证实Cu2-xSe NPs的神经毒性作用。小鼠纹状体和海马神经组织切片H&E染色发现细胞密度降低、液化性坏死、炎症细胞浸润和纤维化等现象，而对照组纹状体和海马组织结构正常，未见核固缩和染色质溶解等现象，表明Cu2-xSeNPs可引起BALB/c小鼠纹状体和海马神经组织损伤；与对照组比较，Cu2-xSe NPs处理组小鼠纹状体和海马神经组织切片内TUNEL染色阳性、caspase-3阳性细胞数均显著升高，提示纳米粒诱导神经细胞凋亡和神经毒性；给药组小鼠纹状体和海马神经组织内H2O2、MDA水平的升高和SOD活力、GSH含量的下降，表明Cu2-xSe NPs引起BALB/c小鼠中枢神经系统毒性与氧化应激作用有关。
结论：
1．Cu2-xSe NPs进入PC-12细胞后，定位于线粒体，对其造成损伤，影响细胞内氧化还原平衡体系，进而产生细胞毒性，毒性作用具有浓度和时间依赖性，毒性机制与线粒体损伤和氧化应激作用有关。
2．Cu2-xSe NPs尾静脉注射BALB/c小鼠体内后，对小鼠脑纹状体和海马组织造成损伤，产生神经系统毒性，毒性作用与氧化应激机制有关。
3．综合体内外实验结果，Cu2-xSe NPs具有神经方面毒性，毒性机制与氧化应激作用有关，为Cu2-xSe NPs更加安全广泛的生物学应用提供了毒理学实验基础，研究具有深远意义。