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杆状病毒作为一类大型双链DNA病毒,是许多昆虫的病原体。在病毒与宿主的共同进化过程中,杆状病毒与宿主昆虫之间发生了复杂的相互作用,促进了宿主防御机制的升级以及病毒攻击策略的演变。病毒与宿主的相互作用可以分为两个方面:首先是杆状病毒对宿主的影响,包括阻断宿主细胞周期、诱导宿主细胞凋亡、调节宿主生长发育以及捕获宿主的一些基因等;其次是宿主昆虫对杆状病毒的复制增殖的影响,包括影响病毒复制、调控杆状病毒的基因表达、抑制病毒的增值等。本文以家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV）中超氧化物歧化酶基因（superoxide dismutase,sod）作为研究对象,利用Red同源重组的技术以及Bac-to-Bac系统构建了四种重组型Bacmid（Baculovirus plasmid）,分别从细胞水平和个体水平,检测BmNPV-sod基因缺失后对病毒复制、细胞中活性氧（reactive oxygen species,ROS）的水平、细胞形态、幼虫的存活时间以及个体变化等的影响,探究BmNPV-sod基因在病毒感染过程中的作用,主要研究结果如下:1、BmNPV-sod敲除对病毒复制及细胞凋亡的影响利用Red同源重组的技术以及Bac-to-Bac系统构建了四种重组型Bacmid,分别是野生型（WT-Bacmid）、BmNPV-sod敲除型（sod-ko-Bacmid）、BmNPV-sod回复突变型（BmNPV-sod-re-Bacmid）,以及宿主同源基因Bm-sod回复突变型（Bm-sod-re-Bacmid）。将四种重组型Bacmid分别转染BmN-SWU1细胞,收取第二代病毒进行感染实验,荧光显微镜观察被感染的细胞中绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）的表达情况,结果发现,转染后24h、48h和72h,细胞中EGFP的表达无明显差异,并且四种重组病毒的感染也没有明显差异。因此,Bacmid转染以及病毒感染细胞实验表明,sod基因缺失不影响出芽生型病毒（Budded virus,BV）的产生,BmNPV-sod为病毒复制的非必须基因,并且BmNPV-sod和宿主sod都能修复杆状病毒中sod基因的缺失。为了检测BmNPV-SOD在病毒感染过程中是否具有活性,将四种重组病毒分别感染BmN-SWU1细胞,分析病毒感染后细胞内ROS水平,结果发现,与其他重组型病毒感染后的细胞相比,BmNPV-sod敲除型病毒感染后细胞内ROS水平明显高于野生病毒和回复突变型病毒感染后细胞内ROS水平。同时,我们也对细胞内SOD活性进行了检测分析,结果发现,sod敲除型病毒感染后细胞内SOD活性明显低于野生型和两种回复突变型病毒。为了进一步探究BmNPV-sod的功能,我们对四种重组病毒感染后的BmN-SWU1细胞进行了Hoechst 33258和TUNEL染色,结果发现,与野生型和两种回复突变型病毒相比,在感染后24 h,36 h和48 h,sod敲除型病毒感染后的细胞凋亡现象的更为明显,该结果暗示了BmNPV-sod可能参与病毒引起的细胞凋亡反应。为了进一步证实这一实验结果,我们检测了四种重组病毒感染后细胞内Caspase-3活性,结果发现,sod敲除型病毒感染后细胞内Caspase-3活性明显高于野生型和回复突变型病毒。同时,我们也分析了凋亡相关基因的表达情况,结果表明,相比于其他重组病毒,sod敲除型病毒感染后细胞内caspase-3,-8和-9的表达水平明显高于野生病毒和回复突变型病毒感染后细胞内的caspase-3,-8和-9的表达水平。以上实验结果表明,BmNPV感染家蚕BmN-SWU1细胞时会诱导宿主发生细胞凋亡,BmNPV-sod在一定程度上抑制了病毒引起的细胞凋亡反应。2、BmNPV-sod敲除对病毒感染后家蚕个体的影响为了探究BmNPV-sod基因缺失对家蚕幼虫的影响,将四种重组病毒分别以50,000、5,000、500及50 PFU/头的剂量注射五龄起蚕,分析计算四种重组病毒的半数致死时间LT50,结果发现,与野生型和回复突变型病毒相比,sod敲除型病毒感染后的幼虫半数致死时间LT50提前10.5～20.3 h,野生型和两种回复突变型病毒感染后的幼虫半数致死时间LT50基本没有差异。同时,我们对四种重组病毒感染后幼虫的存活率进行统计分析,结果发现,在病毒滴度为5,000、500及50 PFU/头时,sod敲除型病毒感染后家蚕幼虫的存活率则明显低于野生型和两种回复突变型重组病毒感染后的幼虫存活率,这进一步说明了sod基因会延缓病毒感染后幼虫的死亡时间。此外,我们也检测了病毒感染后幼虫脂肪体中SOD活性,结果发现,在用不同病毒滴度（5,000/头、500/头及50 PFU/头）感染时,与其他几种病毒感染的家蚕相比,BmNPV-sod敲除型病毒感染家蚕的脂肪体SOD酶活性均为最低。为了探究BmNPV-sod基因在病毒感染过程中对宿主的影响,将四种重组病毒以5,000 PFU/头的滴度注射五龄起蚕,解剖观察病毒感染后家蚕幼虫脂肪体,结果发现,在病毒感染后第五天时,BmNPV-sod敲除型病毒感染后的脂肪体发生解离并且呈卷曲状结构,而野生型和回复型病毒感染家蚕的脂肪体无此现象。我们对幼虫脂肪体细胞进行Hoechst 33258染色,结果发现,与其他重组病毒相比,感染BmNPV-sod敲除型病毒后,脂肪体细胞凋亡现象更明显。该结果表明,BmNPV-sod的敲除在病毒感染家蚕个体时影响了家蚕组织细胞凋亡和组织的形态变化。为了进一步证明该结果,我们检测了脂肪体中Caspase-3活性,结果发现,sod敲除型病毒感染后Caspase-3活性明显高于野生型和回复突变型病毒。利用RT-qPCR技术分析脂肪体组织中凋亡相关基因的相对表达水平,结果发现,感染BmNPV-sod敲除型病毒后caspase-3,-8和-9基因的表达明显发生上调。以上实验结果在家蚕个体水平上证明,BmNPV-sod参与了病毒引起的家蚕细胞凋亡和组织降解。3、BmNPV-sod敲除对病毒感染后表皮液化的影响我们观察并比较了四种重组病毒感染后家蚕幼虫表皮的形态学变化,苏木精伊红（H&E）染色结果表明,四种重组病毒感染后的幼虫表皮在第四天时没有显著差异。随着感染时间的增加,与野生型和回复突变型病毒相比,BmNPV-sod敲除型病毒感染后第五天时,幼虫表皮明显变薄。随后,我们对表皮进行了几丁质染色,结果发现,感染后第四天,表皮中几丁质没有明显变化。然而,sod敲除型病毒感染后第五天时,表皮中几丁质明显变少。为了探究sod敲除型病毒感染后表皮差异变化的原因,我们探究了与宿主液化相关基因BmNPV-chitinase和BmNPV-cathepsin的表达情况。首先,我们利用RT-qPCR技术检测四种重组病毒感染后第五天时BmNPV-chitinase和BmNPV-cathepsin的相对表达水平,结果发现,sod敲除型病毒感染后BmNPV-chitinase和BmNPV-cathepsin的表达水平明显高于其他三种重组病毒。Western Blot检测结果表明,感染sod敲除型病毒的家蚕幼虫中BmNPV-Chitinase和BmNPV-Cathepsin含量显著升高。其次,我们分析了四种重组病毒感染后BmN-SWU1细胞中BmNPV-chitinase和BmNPV-cathepsin的表达变化,结果发现,与其他重组病毒相比,BmNPV-sod敲除型病毒感染细胞后,BmNPV-chitinase和BmNPV-cathepsin基因的表达水平显著升高。以上实验结果证明,BmNPV-sod敲除对病毒的BmNPV-chitinase和BmNPV-cathepsin基因的表达变化产生了影响,在个体和细胞水平上都上调了两个基因的表达,促进了病毒诱导的液化现象的发生,以上结果对于人们认识BmNPV-sod的功能提供了重要的线索。