论文部分内容阅读
昆虫体内栖息着大量的微生物,这些微生物与宿主昆虫在长期协同进化过程中形成了相互依存的共生关系,称为昆虫共生菌（symbionts）。这些共生菌几乎参与了宿主昆虫所有的生命活动,不仅能够调控宿主的营养、代谢、免疫、生殖等,在其适应、进化和多样性方面发挥了巨大作用,还可以通过调控宿主的免疫或生理机能直接或间接地影响介体昆虫对病毒的传播扩散。烟粉虱Bemisia tabaci是世界范围内的超级入侵害虫和植物病毒重要的传播媒介,给农业生产造成了严重损失,其中瓜类褪绿（Cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV）由烟粉虱以半持久方式特异性传播,近年来对世界上多个国家和地区的瓜类作物造成了严重危害。然而,烟粉虱内共生菌与CCYV的传播之间的互作关系尚不清楚。本研究以昆虫共生菌为研究对象,以健康/去除次生共生菌Rickettsia的烟粉虱及其传播的半持久性病毒CCYV及寄主植物黄瓜为研究体系,系统研究CCYV对烟粉虱内共生菌多样性的影响及次生共生菌Rickettsia介导下烟粉虱-CCYV-植物的互作关系。期望本论文的研究能为进一步理解内共生菌对昆虫传播半持久植物病毒方面的影响机理提供新例证,为设计基于内共生菌的控制介体昆虫及其传播的植物病毒的新策略奠定理论基础。论文的研究结果如下:（1）CCYV对烟粉虱内共生菌组成及其多样性的影响对携带CCYV的烟粉虱和健康烟粉虱进行高通量测序,直观对比烟粉虱感毒前后内共生菌的差异。烟粉虱感染CCYV后,变形菌门Proteobacteria和放线菌门Actinobacteria相对丰度均显著上升,而拟杆菌门Bacteroidetes相对丰度反而显著下降。在属水平,感染CCYV后,烟粉虱体内Rickettsia相对丰度显著增加,而Hamiltonella、Acinetobacter等菌属相对丰度显著降低,且健康烟粉虱体内共生菌分布更为均匀。同时,感染CCYV显著降低烟粉虱体内共生菌群落的丰富度。这些结果说明CCYV显著影响烟粉虱共生菌菌群组成、结构及其物种多样性。（2）CCYV对烟粉虱蜜露微生物组成及其多样性的影响收集携带CCYV的烟粉虱和健康烟粉虱分泌的蜜露,对蜜露中的细菌进行高通量测序。结果显示:烟粉虱携带CCYV后分泌的蜜露中变形菌门Proteobacteria相对丰度显著增加,放线菌门Actinobacteria和厚壁菌门Firmicutes显著降低。在属水平上,感染CCYV后,蜜露中Brachybacterium、Paraburkholderia和Herbaspirillum相对丰度显著降低,而Pantoea相对丰度显著上升,成为优势菌属。同时,感染CCYV对烟粉虱蜜露微生物菌群的丰富度没有显著影响,但却显著降低其多样性,说明CCYV显著影响烟粉虱所分泌的蜜露微生物菌群组成、结构及其物种多样性。（3）次生共生菌Rickettsia对烟粉虱-植物-病毒互作关系的影响通过观测R+型（携带Rickettsia）和R-型（去除Rickettsia）烟粉虱分别在感染CCYV植株和健康植株上的生物学特性（包括产卵量、卵孵化率、存活率）,发现R-型烟粉虱的产卵量显著低于R+型烟粉虱,且R-型烟粉虱在健康黄瓜植株上的产卵量最低,R+型和R-型烟粉虱的卵孵化率及存活率没有显著差异。其次,在分析R+型和R-型烟粉虱对于感毒和健康黄瓜植株的自由选择趋向性实验中,发现携带Rickettsia的烟粉虱显著趋向于在感毒黄瓜植物上取食,而消除Rickettsia的烟粉虱对感毒和健康寄主均没有表现出明显的选择趋向性;进一步,对R+型和R-型烟粉虱取食感毒和健康黄瓜植株后的蜜露分泌量进行了测定,发现R+型和R-型烟粉虱取食感毒植株后分泌的蜜露量均显著高于在健康植株上分泌的蜜露量,且R-型烟粉虱无论取食感毒植株还是健康植株,其分泌的蜜露量均显著低于R+型烟粉虱的;最后,采用刺探电位技术（EPG）系统监测了R+型和R-型烟粉虱在感毒和健康黄瓜植株的取食行为,发现两种烟粉虱在取食感毒和健康黄瓜植株时np波的总持续时间以及pd波的总次数存在明显差异。以上结果说明,CCYV不仅提升了寄主植物对于介体烟粉虱的吸引作用,还显著增加了介体烟粉虱的取食量,同时也证明了Rickettsia可以影响介体烟粉虱的寄主选择偏好以及取食行为。（4）次生共生菌Rickettsia对烟粉虱传毒能力的影响以建立的RT-PCR方法检测单头烟粉虱和寄主植物的带毒情况,应用于测定共生菌Rickettsia对烟粉虱传播CCYV的调控作用（包括获毒时间、持毒时间、传毒效率）。首先,分析了未消除共生菌Rickettsia烟粉虱种群（R+型烟粉虱）和消除Rickettsia烟粉虱种群（R-型烟粉虱）获毒率和获毒量的差异,结果表明:R+型和R-型烟粉虱对CCYV获毒率均无显著性影响（P＞0.05）,但取食感毒黄瓜植株24 h和48 h后,R-型烟粉虱体内的病毒滴度显著降低（P＜0.05）;接下来,测定了R+型和R-型烟粉虱对CCYV的持毒时间,结果表明:烟粉虱在消除共生菌Rickettsia后,其对病毒的保留时间无显著差异（P＞0.05）,病毒在两个烟粉虱种群体内均可维持15 d,但R-型烟粉虱在取食棉花植株9 d,12 d,15 d后体内的病毒滴度显著降低（P＜0.05）;最后,对比了R+型和R-型烟粉虱传毒率的差异,烟粉虱消除Rickettsia菌后传毒效率从77.78%下降到53.33%。以上结果证明了次生共生菌Rickettsia可以显著提高烟粉虱传播CCYV的能力,增加烟粉虱获毒量,减缓病毒滴度的降低速率,但对烟粉虱获毒能力以及持毒时间无显著影响。综上,本论文研究证明了CCYV显著影响了介体烟粉虱体内共生菌的组成结构以及多样性,其分泌的蜜露中微生物菌群的结构及丰度也显著不同,同时阐明了次生共生菌Rickettsia对烟粉虱的生殖机能、寄主偏好性、取食行为以及取食量有明显的调控作用,显著提高了烟粉虱传播CCYV的能力。