【摘 要】
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目的: 以慢病毒为载体、构建针对CDC25B产生干扰效果的重组质粒，为研究基因沉默前后细胞生物学行为的改变和探讨CDC25B基因在胰腺癌发生发展中的作用提供实验基础。方法: 在Genebank中检索目的基因的序列，设计、合成5对针对CDC25B基因shRNA的寡核苷酸序列。用Lipofectamine2000将表达CDC25B的pcDNA3．1-FLAG-CDC25B质粒转染至293T细胞，36h
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目的: 以慢病毒为载体、构建针对CDC25B<,3>产生干扰效果的重组质粒，为研究基因沉默前后细胞生物学行为的改变和探讨CDC25B<,3>基因在胰腺癌发生发展中的作用提供实验基础。
方法: 在Genebank中检索目的基因的序列，设计、合成5对针对CDC25B<,3>基因shRNA的寡核苷酸序列。用Lipofectamine2000将表达CDC25B<,3>的pcDNA3．1-FLAG-CDC25B<,3>质粒转染至293T细胞，36h后取一部分细胞做Westernblot，检测CDC25B<,3>的表达情况，确认该细胞中外源性CDC25B<,3>的表达。再将5对针对靶基因的siRNA双链和pcDNA3．1-FLAG-CDC25B<,3>质粒分别共转染293T细胞，24h后Westem blot检测对基因的沉默效果，筛选有效的干扰靶点进行慢病毒载体的构建。
合成有效干扰靶点的寡核苷酸序列，退火形成双链DNA，与经Hpa I和Xho I双酶切后的pGCL-GFP载体连接，转化感受态大肠杆菌DH5a，挑取重组阳性克隆行PCR及测序鉴定，所得慢病毒重组载体为LV-shCDC25B<,3>。
将LV-shCDC25B<,3>、pHelper 1．0和pHelper 2．0质粒共转染293T细胞，包装产生慢病毒，以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒的滴度。
结果: 外源性质粒pcDNA3．1-FLAG-CDC25B<,3>转染293T细胞，Western blot验证该细胞可以表达CDC25B<,3>；然后将该质粒和针对靶基因的5对siRNA双链共转染293T细胞，24h后Western blot检测结果显示1～3＃靶点对目的基因沉默效果明显。根据其对CDC25B<,3>的抑制率以及siRNA设计原则和参数分析，最后确定用2＃有效靶序列进行慢病毒载体构建。
重组阳性克隆PCR鉴定结果显示，CDC25B<,3>基因干扰的重组细菌克隆PCR产物409bp(插入片段为59bp)，经双酶切后对照组pGCL—GFP空载体的PCR产物为350bp，鉴定结果和预期一致。测序结果表明合成的CDC25B<,3> shRNA核苷酸序列插入正确，中间为产生针对靶基因的shRNA寡核苷酸，两端下划线为核酸内切酶HpaI和Xho I酶切位点。以LV-shCDC25B<,3>，pHelper 1.0和pHelper 2.0质粒共转染293T细胞，在倒置显微镜下观察各孔中GFP表达含量，病毒滴度为表达GFP的细胞数除以相应的稀释倍数，测定滴度为1×10<8>TU/ml，说明有大量质粒转入293T细胞，病毒包装成功。
结论: PCR和测序结果证实，成功的构建了人CDC25B<,3>基因RNAi慢病毒载体。
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