乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一,近年来乳腺癌治疗方式不断进展,由手术、化疗、放疗、内分泌治疗、分子生物靶向治疗和中医药治疗结合的综合治疗已成为当前治疗乳腺癌的主流模式,乳腺癌的治疗疗效不断提高,已成为预后较好的实体肿瘤之一。但是,目前全球乳腺癌的发病率逐年上升,在中国,乳腺癌的发病率也已成为女性恶性肿瘤的第一位,并且有年轻化的趋势,成为威胁女性身心健康的头号杀手。乳腺癌的生成和发展过程与众多肿瘤相关因子表达异常和功能改变相关,深入研究这些肿瘤相关因子的功能和作用机制是发现乳腺癌治疗新靶点的重要方法。MicroRNAs (miRNAs)是一类长约18-25个碱基的小分子非编码RNA,这些miRNA可以通过其3’UTR区与靶基因结合从而参与调节基因的表达,其方式主要是通过mRNA的降解或抑制蛋白翻译过程。因此,miRNA在许多生物学功能上都有着重要的作用,例如胚胎发育、细胞增殖和分化以及肿瘤的形成。目前已经有很多研究证实miRNA有促进或抑制肿瘤的功能,并且在许多肿瘤均有异常表达。迄今,已经有研究显示在乳腺癌中有多种miRNA表达异常,进一步研究miRNA在乳腺癌中的功能及作用机制能够帮助我们更好的理解乳腺癌的发生发展过程,并且能够为乳腺癌的诊断和治疗提出新的策略。miR-99a作为肿瘤抑制基因在多种肿瘤中表达下调,并且参与肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡等过程。目前尚未有文献报道miR-99a在乳腺癌中的功能作用,因此这篇文章的目的是探索miR-99a在乳腺癌中的生物学功能和机制,我们的发现也将为乳腺癌的治疗提供一个潜在的靶点。第一章miR-99a在乳腺癌组织和细胞中的表达及意义目的：研究miR-99a在乳腺癌组织和不同细胞株中的表达特点。方法：提取组织及细胞中的总RNA,采用实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR)检测miR-99a在乳腺癌组织及正常乳腺组织、人正常乳腺上皮细胞系HBL-100和4种乳腺癌细胞系(MCF-7、 MDA-MB-231、MDA-MB-435s、SKBr-3)中的表达,并分析其意义。结果：miR-99a在乳腺癌组织中的表达显著低于正常组织；4种乳腺癌细胞(MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435s、SKBr-3)中miR-99a的表达显著低于正常乳腺上皮细胞系HBL-100。结论：miR-99a在乳腺癌组织和细胞中的表达均显著低于正常乳腺组织和细胞。第二章miR-99a对乳腺癌细胞生物学行为的影响目的：研究高表达miR-99a对于乳腺癌细胞MCF-7、 MDA-MB-231增殖、凋亡的生物学行为影响。探讨miR-99a对乳腺癌裸鼠皮下种植瘤生长的抑制作用,运用体内实验进一步证明miR-99a是一种新的抑癌基因。方法：1.实验按照每株细胞各分作三组：MCF-7-MOCK细胞组(空白组)、MCF-7-NC细胞组(阴性对照)、MCF-7-99a细胞组(实验组)；MDA-MB-231-MOCK细胞组(空白组)、MDA-MB-231-NC细胞组(阴性对照)、MDA-MB-231-99a细胞组(实验组)。2.MTT实验绘制各组细胞生长增殖曲线,评价miR-99a对于MCF-7、 MDA-MB-231细胞增殖能力的影响。3.FCM流式细胞仪分析技术检测各组细胞的细胞周期,评估miR-99a对于MCF-7、MDA-MB-231细胞周期的影响。4.Annexin V-PI流式细胞学检测各组细胞的细胞凋亡情况,评价miR-99a对MCF-7、MDA-MB-231细胞凋亡的影响。5.构建miR-99a真核表达载体CMV-miR-99a及对照质粒CMV-HK,分别转染MDA-MB-231细胞,经浓度为10ug/mL的Blasticidin-DMEM培养基筛选出稳定表达miR-99a的细胞系MDA-MB-231-99a以及稳定表达对照序列的细胞系MDA-MB-231-NC.6.RT-PCR检测miR-99a在各组细胞中的表达,证明稳定转染成功。7.将18只裸鼠随机分为3组：接种MDA-MB-231-MOCK细胞组、接种MDA-MB-231-NC细胞组、接种MDA-MB-231-99a细胞组。建立人乳腺癌裸鼠皮下种植瘤模型。8.致瘤成功后每5天测量种植瘤的体积,绘制肿瘤生长曲线。30天后处死裸鼠,切取肿瘤并比较各组瘤重。结果：1.MTT法绘制细胞生长曲线,MCF-7-MOCK组和MCF-7-NC组之间生长曲线无显著性差异(P>0.05), MCF-7-99a组与MCF-7-MOCK组和MCF-7-NC组之间生长曲线有显著性差异(P＜0.05); MDA-MB-231-MOCK组和MDA-MB-231-NC组之间生长曲线无显著性差异(P>0.05); MDA-MB-231-99a组与MDA-MB-231-MOCK组和MDA-MB-231-NC组之间生长曲线有明显差异(P<0.05), MCF-7-99a、MDA-MB-231-99a组细胞增殖均显著低于对照组。2.流式细胞仪检测细胞周期结果显示：MCF-7-MOCK, MCF-7-NC、MCF-7-99a各组的亚G1期细胞比分别为(3.68±1.26%)、(4.61±1.77%)、(19.37±2.92%); MDA-MB-231-MOCK、 MDA-MB-231-NC、MDA-MB-231-99a各组的亚G1期细胞比分别为(4.45±1.25%)、(5.10±0.99%)、(21.72±2.15%), MCF-7-99a细胞组和MDA-MB-231-99a细胞组的亚G1期细胞比均高于对照组和空白组,组间差异均具有显著性(P<0.05)；两株细胞对照组及空白组的亚G1期细胞比无显著性差异(P>0.05)。3.Annexin V-PI流式细胞结果显示,MCF-7-MOCK、MCF-7-NC、MCF-7-99a各组的平均凋亡率分别为：(3.82±0.84%)、(4.05±0.94%)、(19.08±1.05%); MDA-MB-231-MOCK、 MDA-MB-231-NC、MDA-MB-231-99a各组的平均凋亡率分别为：(4.47±0.94%)、(4.96±0.87%)、(21.82±1.60%),MCF-7-99a细胞组和MDA-MB-231-99a细胞组的凋亡率均高于对照组和空白组,组间差异均具有显著性(P<0.05)；两株细胞对照组及空白组的凋亡率无显著性差异(P>0.05)。4.经RT-PCR方法检测MDA-MB-231-99a细胞组的miR-99a表达明显高于对照组MDA-MB-231-NC细胞组,证明成功构建稳定表达miR-99a的MDA-MB-231细胞株。5.各组裸鼠皮下接种乳腺癌细胞,5天后均致瘤成功,成瘤率100%。6.绘制各组种植瘤的生长曲线,MDA-MB-231-99a组种植瘤生长速度明显低于MDA-MB-231-MOCK与MDA-MB-NC组(P<0.05)；终止时间第30天时,MDA-MB-231-MOCK组种植瘤体积为(1005.33±89.21)cm3, MDA-MB-231-NC组体积为(912.16±96.36)cm3均明显大于MDA-MB-231-99a组(544.2484±49.12)cm3(P<0.05)MDA-MB-231-MOCK组种植瘤平均重量为(1.20±0.21)g,MDA-MB-231-NC组平均重量为(1.04±0.25)g,均明显大于MDA-MB-231-99a组(0.53±0.09)g(P<0.05)；结论：1.体外细胞实验中,外源性高表达miR-99a能够抑制乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231增殖,将细胞周期阻滞于亚GO期,促进细胞凋亡。2.体内动物实验中,外源性高表达miR-99a可明显抑制人乳腺癌裸鼠皮下种植瘤的生长。第三章miR-99a下游靶基因预测确认及对靶基因mTOR调节作用的研究目的：利用生物信息学原理预测miR-99a可能的作用靶点,并行进一步确认,同时研究miR-99a对靶基因的调节作用。方法：1.通过miRNA靶点预测网站进行miR-99a可能的作用靶点的预测。2.构建miR-99a正义表达模拟物mimics和靶基因3’UTR野生及变异两种荧光素酶载体,应用双荧光素酶报告基因技术分析miR-99a对靶基因的转录激活活性。3.将乳腺癌MCF-7细胞外源性过表达miR-99a,通过RT-PCR, Westernblot对靶基因mRNA、蛋白表达产物进行检测,确定miR-99a对靶基因的调控方式。4.将不含3’UTR的靶基因cDNA导入MCF-7细胞,过表达miR-99a后再次通过Western blot对靶基因蛋白表达产物进行检测,通过逆转miR-99a对靶基因的调节作用进一步确认miR-99a通过靶基因的3’UTR区与之结合。结果：1.生物信息学分析：四种在线数据库TargetScan、miRBase、 miRGenTargets、Pictaralgorithms预测了miR-99a的靶基因mTOR;通过Blast数据库比对,mTOR的3’UTR区存在与miR-99a5’端互相作用的序列。2.双荧光素酶报告基因结果证实了miR-99a与mTOR的3’UTR区结合。3.RT-PCR、Western blot检测到miR-99a在mRNA和蛋白水平均下调mTOR的表达。4.RT-PCR, Western blot检测到不含3’UTR的mTOR不受miR-99a的调控,miR-99a对mTOR的抑制作用可以被逆转。结论：1.mTOR是miR-99a的直接靶基因,其通过3’UTR区与miR-99a结合,受其调控。2.miR-99a通过mRNA和蛋白水平调控mTOR的表达。第四章mTOR在乳腺癌细胞和组织中的表达及其意义目的：研究mTOR在乳腺癌组织和不同细胞株中的表达特点方法：1.提取组织及细胞中的总蛋白质,采用Western blot检测mTOR在乳腺癌组织及正常乳腺组织、人正常乳腺上皮细胞系HBL-100和4种乳腺癌细胞系(MCF-7、MDA-MB-231、 MDA-MB-435s、SKBr-3)中的表达,并分析其意义。2.分析miR-99a与mTOR在乳腺癌组织及细胞中表达的相关性。结果：LmTOR在乳腺癌组织中的表达显著高于正常组织；4种乳腺癌细胞(MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435s、SKBr-3)中mTOR的表达显著高于正常乳腺上皮细胞系HBL-100。2.miR-99a与mTOR在乳腺癌组织及细胞中表达呈显著负相关。结论：LmTOR在乳腺癌组织和细胞中的表达均显著高于正常乳腺组织和细胞。2. miR-99a与mTOR在乳腺癌组织及细胞中表达呈显著负相关。第五章mTOR参与miR-99a介导乳腺癌细胞生物学行为的影响目的：探讨miR-99a对于乳腺癌细胞的生物学行为的影响是否通过靶向调节mTOR而产生,进一步论证miR-99a是通过靶向结合mTOR3’UTR区产生抑癌作用的。方法：1.运用siRNA技术沉默乳腺癌细胞MCF-7中mTOR的表达,实验分作三组：MCF-7-MOCK细胞组、MCF-7-NC细胞组、MCF-7-mTORsiRNA细胞组,通过MTT实验绘制各组细胞生长增殖曲线,评价mTOR对于MCF-7细胞增殖能力的影响。Annexin V-PI流式细胞学检测各组细胞的细胞凋亡情况,评价mTOR对MCF-7细胞凋亡的影响。2.将缺失3’UTR区的mTOR cDNA导入乳腺癌MDA-MB-231细胞中,使细胞内mTOR表达上调,实验分作三组：MDA-MB-231-MOCK细胞组、MDA-MB-231-NC细胞组、MDA-MB-231-mTOR细胞组,通过MTT实验绘制各组细胞生长增殖曲线,评价mTOR对于MDA-MB-231细胞增殖能力的影响。Annexin V-PI流式细胞学检测各组细胞的细胞凋亡情况,评价mTOR对MDA-MB-231细胞凋亡的影响。3.将缺失3’UTR区的mTORcDNA和miR-99mimics共转染乳腺癌MCF-7细胞,论证miR-99a是通过靶向结合mTOR3’UTR区产生抑癌作用。实验分作三组：MCF-7-MOCK细胞组、MCF-7-99a细胞组、MCF-7-99a-mTOR细胞组,通过MTT实验绘制各组细胞生长增殖曲线,Annexin V-PI流式细胞学检测各组细胞的细胞凋亡情况,评价miR-99a对于mTOR的调控和抑癌作用在其缺失3’UTR区后的变化。结果：1.MCF-7-mTORsiRNA细胞组与MCF-7-MOCK组和MCF-7-NC组之间生长曲线有显著性差异(P<0.05),实验组细胞增殖显著低于对照组。MCF-7-MOCK、MCF-7-NC、MCF-7-mTORsiRNA各组的平均凋亡率分别为：(3.95±0.89)%、(4.27±0.84)%、(16.90±1.14)%; MCF-7-mTORsiRNA细胞组的凋亡率均高于对照组和空白组,组间差异均具有显著性(P<0.05);2.MDA-MB-231-mTOR细胞组与MDA-MB-231-MOCK组和MDA-MB-231-NC组之间生长曲线有显著性差异(P<0.05),实验组细胞增殖显著高于对照组。MDA-MB-231-MOCK、MDA-MB-231-NC、MDA-MB-231-mTOR各组的平均凋亡率分别为：(4.25±0.07)%、(4.43±0.15)%、(2.19±0.22)%；MDA-MB-231-mTOR细胞组的凋亡率均低于对照组和空白组,组间差异均具有显著性(P<0.05);3.MCF-7-99a细胞组生长曲线与MCF-7-MOCK细胞组相比有显著性差异,细胞增殖明显减低,但MCF-7-99a-mTOR组细胞增殖较MCF-7-99a显著增加(P<0.05)。MCF-7-MOCK、MCF-7-99a、MCF-7-99a-mTOR各组的平均凋亡率分别为：(4.15±1.09)%、(15.85±1.83)%、(8.63±1.19)%, MCF-7-99a细胞组凋亡率较MCF-7-MOCK组明显增高,MCF-7-99a-mTOR细胞组则可逆转miR-99a对于细胞凋亡的抑制,细胞凋亡率较MCF-7-99a组明显降低。结论：1.RNA干扰沉默mTOR基因在乳腺癌细胞中的表达,能够抑制乳腺癌细胞增殖,促进细胞凋亡,与外源性高表达miR-99a对乳腺癌细胞的影响一致。2.乳腺癌细胞中过表达mTOR能够促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,产生致癌作用,与miR-99a对乳腺癌细胞的作用相反。3.miR-99a与缺失3’UTR区的mTOR共转染之后,乳腺癌细胞增殖增加,细胞凋亡减少,产生致癌作用,逆转了miR-99a在乳腺癌细胞中的抑癌作用。4.miR-99a通过与mTOR3’UTR区结合靶向调节mTOR在乳腺癌细胞中发挥抑癌作用。第六章miR-99a对mTOR下游信号分子表达的影响目的：研究miR-99a对mTOR下游信号分子4E-BP1和S6K1在乳腺癌细胞MCF-7中表达的影响,进一步探明miR-99a在乳腺癌中发挥抑癌作用的机制。方法：1.在乳腺癌MCF-7细胞中过表达miR-99a,运用Western blot检测mTOR下游信号分子4E-BP1和S6K1及其磷酸化状态的表达情况。2.在乳腺癌MCF-7细胞中抑制mTOR的表达水平,运用Western blot检测mTOR下游信号分子4E-BP1和S6K1及其磷酸化状态的表达情况。3.在乳腺癌MCF-7细胞中共转染miR-99a和缺失3’UTR区的mTORcDNA,运用Western blot检测mTOR下游信号分子4E-BP1和S6K1及其磷酸化状态的表达情况。结果：1.过表达miR-99a使得乳腺癌细胞中活化状态的4E-BP1和S6K1即P-4E-BP1和P-S6K1表达较对照组减低(P<0.05),本体状态无明显变化(P>0.05)。2.沉默mTOR同样使得乳腺癌细胞中P-4E-BP1和P-S6K1表达较对照组减低(P<0.05),本体状态无明显变化(P>0.05)。3.共转染miR-99a和缺失3’UTR区的mTOR cDNA之后,乳腺癌细胞中P-4E-BP1和P-S6K1表达较MCF-7-99a组增高(P<0.05),本体状态无明显变化(P>0.05)。结论：1. miR-99a作用于mTOR抑制其表达的同时也抑制了mTOR下游信号分子4E-BP1和S6K1的磷酸化活化过程,使P-4E-BP1和P-S6K1表达下降。2.沉默mTOR同样也使得P-4E-BP1和P-S6K1表达下降,与过表达miR-99a的作用效果一致。3.共转染miR-99a和缺失3’UTR区的mTOR cDNA之后,P-4E-BP1和P-S6K1表达上调,无3’UTR区的mTOR cDNA逆转了miR-99a的作用。4. miR-99a通过与mTOR3’UTR区结合靶向调节mTOR,从而影响了mTOR下游信号分子4E-BP1和S6K1的活化过程,最终抑制肿瘤细胞的生长增殖,促进凋亡。