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背景:Rho guanine nucleotide dissociation inhibitorα(RhoGDIα)是Rho GTPases重要的负调控因子。RhoGDIα与Rho GTPases的结合直接影响细胞迁移中Rho GTPases局部激活。然而,RhoGDIα不同位点磷酸化在剪切应力诱导其亲和度变化中的作用还不明确。材料和方法:本文采用经典的平行平板流动腔系统对细胞施加流体剪切应力刺激,利用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)探针(sl-RhoGDIα)检测剪切应力作用下RhoGDIα和Rho GTPases在人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC)中的亲和度变化。构建RhoGDIα磷酸化变体(sl-S101E/S174E,sl-Y156E,sl-S101E,sl-S174E)以及非磷酸化变体(sl-S101A/S174A,sl-Y156A,sl-S101A,sl-S174A)的FRET探针,检测磷酸化在剪切应力作用下RhoGDIα与Rho GTPases亲和度变化中的作用。利用PBD-GFP探针检测HUVEC内Rac1的活性分布。FRET显微镜采集荧光图像,通过Matlab软件编程进行图像分析处理。结果:(1)测序结果表明,RhoGDIα磷酸化变体探针中RhoGDIα序列的磷酸化位点成功突变为丙氨酸或谷氨酸,这些磷酸化变体探针可在HUVEC正常表达且并不影响细胞功能状态。(2)剪切应力作用30 min后,对照组sl-RhoGDIα、sl-Y156A和sl-Y156E的FRET ratio都明显降低,且细胞下游FRET ratio的下降幅度大于细胞上游。sl-Y156A的FRET ratio整体下降幅度小于对照组,而sl-Y156E的FRET ratio整体下降幅度大于对照组。(3)抑制PAK1激酶活性后,剪切应力下sl-RhoGDIα的FRET ratio整体下降幅度减少,上下游FRET ratio的下降幅度无明显差异。类似地,sl-S101A/S174A的FRET ratio下降幅度也小于对照组,且无上下游差异。(4)剪切应力下sl-S101A和sl-S174E的FRET ratio整体下降幅度小于对照组,sl-S101A和sl-S174A的FRET ratio下降幅度在细胞上下游间没有差异。(5)剪切应力作用下,PBD-GFP荧光逐渐向细胞下游聚集。过表达S101A/S174A、S174A、S101A变体后,PBD-GFP荧光向下游聚集现象消失。结论:本文成功构建了检测RhoGDIα变体与Rho GTPases亲和度的FRET探针。剪切应力作用下,HUVEC内RhoGDIα-Rho GTPases解离主要受RhoGDIαTyr156位点磷酸化调节。而RhoGDIα-Rho GTPases亲和度极性和活化的Rac1下游聚集主要受到PAK1激酶介导的RhoGDIαSer101/Ser174位点磷酸化调节,与Tyr156位点磷酸化无关。因此,剪切应力下RhoGDIα不同磷酸化位点在调节RhoGDIα-Rho GTPases解离和亲和度极性中发挥着不同的作用,为深入理解内皮细胞应力传导机制提供了依据。