Nrf2在黄芩素抑制氧化应激诱导心肌细胞凋亡中的作用研究

来源 :广州医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zhang_yingliang
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【研究背景】心血管疾病是我国发病率和死亡率最高的疾病之一,给我国医疗服务造成了沉重的负担。氧化应激是指机体氧化和抗氧化作用失衡,偏向于氧化,大量活性氧的生成导致组织和细胞的损伤。既往研究表明氧化应激与心血管疾病的发生发展密切相关。核因子E2相关因子2(Nrf2)作为抗氧化应激的关键转录因子,具有广泛的生理作用,如抗氧化、蛋白质调节、代谢调节、细胞增殖、自噬等。研究显示Nrf2信号通路在如高血压、心肌梗死、心室重构、心力衰竭等心血管疾病中发挥明显的保护作用,是心血管疾病防治中极具潜力的靶点。黄芩素是一种黄酮类化合物,是中药黄芩的主要活性成分之一。研究显示黄芩素具有抗菌、抗肿瘤、抗过敏、抗氧化等药理作用,然而根据目前研究并不清楚黄芩素在改善心肌细胞氧化应激和凋亡的潜在机制。本研究将探讨黄芩素在减少心肌细胞凋亡和提高其抗氧化应激能力的作用,并试图探索可能的分子机制,为黄芩素的临床运用提供实验室依据。【研究方法】1.通过叔丁基过氧化氢(TBHP)(100~600μmol/L)刺激H9c2细胞,MTS法检测H9c2细胞的活力,探索建立体外细胞氧化应激模型的条件。2.给予不同浓度的黄芩素(2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)分别预处理H9c2细胞12 h,再给予叔丁基过氧化氢刺激2 h建立氧化应激模型,MTS法检测细胞活力;采用TUNEL染色检测细胞凋亡情况;采用Western Blot法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达;采用比色法检测超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的活性。3.采用分子动力学和表面等离子共振技术评估黄芩素与Keap1的相互作用。4.给予不同浓度的黄芩素(2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)处理H9c2细胞12 h,Western blot检测Nrf2、HO-1、NQO1的表达。5.使用黄芩素(10μmol/L)、ML385(20μmol/L)、黄芩素(10μmol/L)+ML385(20μmol/L)预处理H9c2细胞12 h后再给予叔丁基过氧化氢刺激2 h建立氧化应激模型。采用MTS法检测细胞活力;采用TUNEL染色检测心肌细胞凋亡情况;采用Western blot法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达;采用比色法检测SOD、GSH-PX的活力;使用Western blot法检测在使用ML385抑制Nrf2后,黄芩素对Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达的影响。6.使用异丙肾上腺素腹腔注射构建心肌细胞损伤小鼠模型,采用TUNEL染色及Western blot法检测小鼠心肌细胞凋亡率及凋亡相关蛋白;Western blot法检测黄芩素对异丙肾上腺素诱导小鼠心肌细胞凋亡后Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达的影响。【结果】1.不同浓度的叔丁基过氧化氢(100μmol/L、200μmol/L、300μmol/L、400μmol/L、500μmol/L、600μmol/L)处理H9c2细胞2 h的MTS结果显示,叔丁基过氧化氢能抑制细胞活力且呈浓度依赖性(P<0.01),当叔丁基过氧化氢浓度为200μmol/L时H9c2细胞存活率约为75%,选取该浓度作为后续实验建立H9c2细胞氧化应激模型的浓度。2.黄芩素(2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)预处理12 h,叔丁基过氧化氢刺激2 h建立H9c2细胞氧化应激模型,结果显示,黄芩素预处理能够剂量依赖性地提高H9c2细胞活力,减少细胞凋亡,提高Bcl2/Bax相对表达量的比值,提高SOD、GSH-PX的活性。3.分子动力学及表面等离子共振的结果表明黄芩素与Keap1的Kelch位点结合十分稳定,Keap1-黄芩素蛋白复合物能够稳定存在。4.使用Western Blot法检测了黄芩素(2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)对H9c2细胞内Nrf2的直接作用。结果显示黄芩素能剂量依赖性地上调H9c2细胞内Nrf2、HO-1、NQO1的表达(P<0.01)。5.ML385抑制Nrf2后,TUNEL细胞凋亡染色、SOD和GSH-PX活性试剂盒和Western blot的结果显示ML385能够阻断黄芩素对心肌细胞凋亡的保护作用,且黄芩素提高H9c2细胞抗氧化能力及上调Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达的作用被抑制。6.黄芩素可以上调异丙肾上腺素诱导的小鼠心肌细胞内Nrf2、HO-1、NQO1的表达,减少细胞凋亡。【结论】黄芩素通过激活Nrf2信号通路抑制氧化应激诱导心肌细胞凋亡。
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