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前言肥胖（obesity）作为多种慢性疾病及恶性肿瘤的危险因素,已严重威胁着人类的身心健康。肥胖基因（ob gene）及其编码产物瘦素（leptin）的发现,为肥胖在分子生物学水平的研究奠定了基础。研究证实在大多数肥胖者和啮齿类动物中存在着明显的瘦素抵抗（leptin resitance,LR）,即对瘦素减少体重信号反应能力降低。细胞因子信号转导抑制因子-3（suppressor of cytokine signaling 3,SOCS-3）由瘦素诱导产生,是瘦素信号转导的负反馈抑制因子,通过抑制瘦素信号转导通路发挥作用。SOCS-3是胰岛素、生长激素等多种激素的抑制因子,在中枢抑制其表达可能影响其他激素发挥其正常生理功能。因此,本研究首先通过建立高脂饮食诱导的肥胖（diet-induced obesity,DIO）大鼠模型,检测脂肪组织中SOCS-3 mRNA表达情况;然后,应用慢病毒载体（lentivirus vector）介导的RNA干扰（RNAinterference,RNAi）技术在体外进行DIO大鼠脂肪细胞SOCS-3基因敲除,减少或阻断肥胖大鼠脂肪细胞内SOCS-3的表达,观察其对脂肪细胞代谢的影响。材料与方法一、饮食诱导肥胖大鼠模型的建立及指标检测（一）建立饮食诱导肥胖大鼠模型40只雄性Wistar大鼠适应性饲养1w后,按体重随机分为2组:对照组7只喂饲普通基础饲料,高脂组33只喂饲高脂饲料,高脂饲料含基础饲料73%、猪油20%、酪蛋白7%。第8w末,按体重增量大于对照组体重增量均值加上1倍标准差作为肥胖标准,从高脂组中筛选出10只大鼠作为肥胖组,5只处死用于血脂及附睾周围脂肪组织SOCS-3 mRNA指标检测,5只用于大鼠原代脂肪基质细胞培养。实验结束时,乙醚麻醉大鼠,腹主动脉采血,分离血清。（二）血脂的测定按试剂盒说明,用半自动生化分析仪测定血清中总胆固醇（total cholesterolTC）、甘油三酯（triglyceride,TG）含量。（三）脂肪组织SOCS-3 mRNA表达量测定按TRIzol说明书操作步骤,提取100mg左右大鼠附睾周围脂肪组织的总RNA。取总RNA量1μg,按Takara RNA PCR试剂盒说明,进行RT-PCR反应。取2μl cDNA为模板,以β-actin作为内参对照。各指标反应条件相同,RT-PCR反应条件为:30℃10min,42℃30min,99℃5min,5℃5min。PCR反应条件:94℃,2min预变性;扩增的35个循环包括:变性94℃30s、退火56℃30s、延伸72℃1min。再72℃延伸10min。5μl目的基因产物,加预染液预染3min;2%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像分析仪拍照,以与内参对照β-actin的比值作为目的基因表达的相对含量。二、大鼠原代脂肪基质细胞分离培养及成脂诱导分化无菌条件下,取肥胖组大鼠附睾周围脂肪组织,去除血管和其他组织,PBS反复清洗。加入牛血清白蛋白和Ⅱ型胶原酶混合物消化。过250μm筛网,50xg离心10min,200xg离心10min。加红细胞裂解液,室温静置5～10min,过25μm筛网,200xg离心5min 2次。加基础培养基混悬后,接种到12孔板中。37℃、5%CO2条件下培养。当原代培养的大鼠脂肪基质细胞长成单层后,用PBS洗2次,更换为诱导分化培养基培养,3d后,更换去除异丁基-甲基黄嘌呤和罗格列酮的诱导分化培养基,隔日换液。10d后,油红O染色鉴定脂肪细胞及分化率。三、SOCS-3 shRNA慢病毒表达载体的构建慢病毒载体委托吉凯基因化学有限公司合成。四、慢病毒感染及瘦素处理肥胖组大鼠原代脂肪基质细胞诱导分化10d后,感染慢病毒,共分3组,每组4个复孔,分别为空白对照组（CON组）,阴性对照病毒组（NC组）,SOCS-3shRNA慢病毒组（KD组）。96h后荧光镜检观察感染率。感染5d后,每组取2孔加大鼠重组瘦素处理6h。五、SOCS-3、ACC和ACO mRNA表达量测定TRIzol提取细胞总RNA,反转录成cDNA,PCR法扩增目的基因,SOCS-3和GAPDH（内参）的退火温度为56℃;ACC和ACO的退火温度为50℃,其它步骤同前。六、统计分析实验结果用（?）±s表示,用SPSS13.0统计软件进行t检验和单因素方差分析,检验水准α=0.05。结果一、实验期间大鼠体重变化喂饲高脂饲料前,两组大鼠体重差异无统计学意义（P>0.05）,但1w后体重开始分化,此后,肥胖组大鼠体重一直高于对照组,至第8w末,肥胖组大鼠体重及体重增量与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。二、第8w末大鼠血脂水平及脂肪组织SOCS-3 mRNA表达情况第8w末大鼠血清总胆固醇和甘油三酯水平,肥胖组显著高于对照组（P<0.05）。而附睾周围脂肪组织中SOCS-3 mRNA表达水平肥胖组也高于对照组,灰度值分析结果显示差异有统计学意义（P<0.05）。三、大鼠原代脂肪基质细胞形态及成脂诱导分化刚接种的大鼠原代脂肪基质细胞呈圆形或类圆形。随着培养时间的增加,细胞变得细长,呈典型的成纤维细胞形,生长比较旺盛。经成脂诱导分化剂诱导48h后细胞变圆,体积增大,胞内有脂滴形成。油红O可将脂滴染成红色,证明诱导所产生的细胞为脂肪细胞。计数分化率约为70%。四、慢病毒感染分化后的大鼠脂肪基质细胞感染72h后荧光镜检观察,CON组无荧光表达,NC组和KD组有绿色荧光表达,感染率约80%。五、感染慢病毒后大鼠脂肪细胞SOCS-3 mRNA表达水平感染SOCS-3 shRNA慢病毒的大鼠脂肪细胞（KD组）SOCS-3 mRNA表达水平低于感染阴性对照慢病毒的大鼠脂肪细胞（NC组）（P<0.05）。SOCS-3基因有效敲减率约为54%。六、各组细胞ACC和ACO mRNA表达水平瘦素处理后,KD组大鼠脂肪细胞ACC mRNA表达水平低于NC组（P<0.05）;而ACO mRNA表达水平,瘦素处理后,KD组高于NC组（P<0.05）。结论1、高脂饮食诱导的肥胖大鼠可能存在外周瘦素信号转导通路抑制。2、SOCS-3 shRNA慢病毒感染DIO大鼠脂肪细胞后,在一定程度上解除了SOCS-3对脂肪细胞中瘦素信号转导通路的抑制,缓解了脂肪细胞的瘦素抵抗。