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研究背景黑色素瘤是皮肤癌中恶性程度最高的肿瘤,患者死亡率约占80%。原发性黑色素瘤患者经传统方法治疗后5年内的生存率可达到95%,但转移性黑色素瘤患者5年内生存率大约只有10%,诱导黑色素瘤发生的主要原因是过度照射紫外线,使被照射部位发生癌变。研究发现恶性黑色素瘤发生于身体各部位的色素细胞,大多数发生在皮肤,少数发生在眼、耳、脑膜等部位。截至目前,全球累计黑色素瘤的发病人数为200～300万例并且还在逐年增加,同时其病死率也在增加,是每年发病人数增加最快的肿瘤类型。由于黑色素瘤容易发生转移,传统方法治疗不容乐观。因此,黑色素瘤已经成为危及人类生命健康的恶性肿瘤之一。支链氨基酸(Branched-chain amino acids,BCAAs)包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸,支链氨基酸转氨酶(Branched-chain amino acid transaminase,BCAT)是催化支链氨基酸第一步分解反应的酶。BCAT包括BCAT1和BCAT2两种类型,BCAT1位于胞质中,BCAT2位于线粒体内,两种同工酶将BCAAs的α-氨基转移至α-酮戊二酸,生成谷氨酸盐及相应的支链酮酸。BCAT1与多种癌症的预后相关,研究表明BCAT1在多种肿瘤类型中高表达,例如肝癌、非小细胞肺癌、卵巢癌及乳腺癌等,但在胰腺导管腺癌中呈低表达,因此BCAT1表达高低因肿瘤类型而异。BCAT1参与肿瘤代谢重编程,并促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,从而促进肿瘤发展,因此BCAT1基因也被称为“长寿基因”。但目前没有关于BCAT1在黑色素瘤中表达及功能的相关研究,我们首次探究BCAT1在黑色素瘤及正常组织中的差异性表达并进一步研究BCAT1在黑色素瘤细胞中的功能,这可能成为黑色素瘤治疗的一个新的分子靶标。研究目的探究BCAT1在黑色素瘤组织与正常组织中的差异性表达,通过构建BCAT1敲低的稳转细胞株探究降低BCAT1表达对黑色素瘤细胞增殖、迁移及代谢的影响,从而为黑色素瘤的治疗提供理论基础。研究方法1通过免疫组化实验检测组织着色强度及阳性细胞染色率确定BCAT1在黑色素瘤组织及正常组织中的差异性表达。2构建慢病毒并转染B16细胞,通过嘌呤霉素筛选B16-BCAT1-sh NC、B16-BCAT1-sh1及B16-BCAT1-sh2的稳转细胞株。3探究降低BCAT1表达对黑色素瘤B16细胞增殖、周期、迁移等细胞功能的影响。(1)通过实时无标记细胞功能仪(RTCA)检测降低BCAT1表达对B16细胞增殖的影响。(2)通过克隆形成实验检测降低BCAT1表达对B16细胞克隆形成能力的影响。(3)通过PI染色检测降低BCAT1表达对B16细胞周期的影响。(4)通过划痕实验探究降低BCAT1表达对于B16细胞迁移能力的影响。4通过Seahorse XF能量代谢实验检测敲低BCAT1对于B16细胞糖酵解及线粒体呼吸的影响。(1)糖酵解压力测试检测敲低BCAT1对于B16细胞糖酵解胞外酸化速率的影响。(2)线粒体压力测试检测敲低BCAT1对于B16细胞线粒体有氧呼吸耗氧量的影响。5通过靶向-能量代谢物代谢组学实验检测敲低BCAT1对糖酵解、TCA循环及氧化磷酸化过程中代谢物质含量的影响。6通过Western blot探究B16-BCAT1-sh NC与B16-BCAT1-sh2细胞中EMT途径标志物及线粒体功能关键酶的表达差异。研究结果1免疫组化实验结果表明BCAT1在恶性黑色素瘤组织中表达高于正常组织。2 q RT-PCR及Western blot检测黑色素瘤细胞B16、A2508、A375、Melan-α及M14共5种细胞株中BCAT1的m RNA水平及蛋白表达,结果表明BCAT1在B16细胞中表达相对较高。3慢病毒转染B16细胞介导BCAT1表达降低,细胞功能实验表明敲低BCAT1抑制B16细胞的增殖、迁移及G2/M细胞周期过程。4糖酵解压力测试结果表明:与对照组相比,外源补充葡萄糖后B16-BCAT1-sh2细胞的ECAR值升高,糖酵解代谢增强。加入寡霉素后抑制ATP合成酶功能,ECAR值没有变化,说明敲低BCAT1对于糖酵解最大值没有影响。加入2-DG抑制己糖激酶活性,ECAR值降低,说明敲低BCAT1降低糖酵解的储备值。5线粒体压力测试结果表明敲低BCAT1抑制了B16细胞线粒体耗氧量,并且线粒体压力测试的基础值、ATP含量、最大值及储备值均有显著降低。6靶向-能量代谢物质检测发现敲低BCAT1导致线粒体TCA循环中的乙酰辅酶A代谢显著性降低,腺苷代谢降低,同时氧化磷酸化过程中FMN和NAD含量显著性降低。7 Western blot结果表明:EMT过程标志物E-Cadherin表达增加而Vimentin表达降低,线粒体TCA循环过程中关键酶如柠檬酸合成酶(Citrate synthase,CS)、丙酮酸脱氢酶(Pyruvate dehydrogenase,PDH)、琥珀酸脱氢酶(Succinate dehydrogenase,SDH)等表达量下降。研究结论1 BCAT1在恶性黑色素瘤组织中表达高于正常组织,敲低BCAT1抑制B16细胞的增殖、迁移及G2/M细胞周期进展。2敲低BCAT1增强B16细胞糖酵解功能然而抑制线粒体代谢功能和B16细胞中乙酰辅酶A、腺苷、FMN及NAD代谢水平。3敲低BCAT1增强B16细胞中E-Cadherin表达并抑制Vimentin的表达,从而抑制EMT途径。4敲低BCAT1抑制B16细胞中线粒体功能相关蛋白表达从而抑制线粒体代谢活动。