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长QT综合征(long QT syndromes,LQTS)是由于心肌复极时间延长引起的一类恶性心律失常,它是造成儿童和青少年猝死的一个主要病因,当前对于遗传性LQTS的治疗方法一般是药物治疗,而且存在一定的局限性,并无法完全根治。长QT综合征发生的分子病理机制也有待进一步研究。在本课题中,我们对LTQ2家系病人进行了HERG(即KCNH2基因)突变筛选,对鉴定出的HERG新突变进行了突变体功能分析,研究了其分子致病机制,并探讨了其挽救方法,希望对将来LQTS疾病的临床个体化治疗提供必要的依据。主要结果:1.我们对HERG直接测序,鉴定出一个新的F68C杂合形式的错义突变。2.我们将带有EGFP标签的野生型HERG-WT质粒和突变型HERG-F68C质粒转染HEK293T细胞,Western blot检测HERG蛋白的表达,发现F68C突变体总蛋白(135KD+155KD)以及155KD蛋白表达均明显减少;共聚焦显微镜观察HERG蛋白的亚细胞定位,发现F68C突变体蛋白细胞膜定位明显减少;膜片钳技术分析发现F68C突变型通道检测不到电流。上述实验表明F68C突变不仅影响HERG蛋白表达,而且影响成熟形式的155KD HERG蛋白上膜转运。3.F68C突变位于HERG钾通道N端PAS(Per-Amt-Sim)区域,为研究突变对PAS的影响,我们将携带FLAG标签的野生型质粒PAS-WT以及突变型质粒PAS-F68C分别转染HEK293T细胞,Western blot检测发现F68C突变体蛋白迁移变慢;提取粗膜(Crude membranes)后进行限制性蛋白酶(Limited Proteolysis,LiP)水解发现F68C突变体蛋白构象可能发生改变;蛋白酶体抑制剂MG132处理后可部分恢复F68C突变体蛋白的表达水平?上述实验表明F68C突变导致了PAS区域蛋白构象发生明显改变,使其容易通过蛋白酶体途径降解。4.我们将WT或F68C质粒转染HEK293T细胞后,分别用含0.1%以及1%TritonX-100的缓冲液裂解细胞,离心后检测上清和沉淀中HERG表达,发现F68C突变体蛋白没有发生明显不溶性聚集;此外,Western blot检测内质网应激Marker蛋白ATF4、ATF6、sXBP1、p-eIF-2a的表达,发现F68C突变也不引起明显的内质网应激反应。5.我们将WT和F68C质粒共转染HEK293T细胞,发现成熟形式155KD HERG成熟形式的蛋白相对于单独转染WT质粒明显减少;为了区分野生型和突变型HERG蛋白的表达和转运上膜,我们构建了不同标签蛋白标记的野生型和突变型HERG表达载体,将FLAG-WT/GFP-WT以及FLAG-WT/GFP-F68C质粒两两共转染HEK293T细胞,分别用GFP以及FLAG抗体进行Western blot分析,发现野生型和突变型质粒共表达时,不仅突变体HERG蛋白不能上膜,而且野生型HERG蛋白上膜量也明显减少;膜片钳技术分析发现F68C和WT共转的HEK293T细胞中,HERG通道电流明显受到抑制。上述实验表明F68C突变干扰WT HERG蛋白的上膜转运,呈现负显性效应。6.我们将F68C质粒转染HEK293T细胞,分别用低温、不同浓度的甘油(5%-10%)、DMSO(0.1%-2%)以及药物(E-4031、VX-809、cisapride、quinidine以及thapisgargin)处理,发现155KD成熟形式的HERG蛋白表达没有明显增加。上述实验表明F68C突变无法采用传统的方式进行挽救。7.我们将WT和F68C质粒共转染HEK293T细胞,发现针对F68C突变形式的siRNA-13能特异性地沉默F68C突变体蛋白的表达,相应地HERG通道电流得到有效恢复;而且siRNA-13处理不影响HEK293T细胞的增殖和凋亡。上述实验表明通过RNAi技术可以挽救F68C突变导致的LQT2综合征。主要结论:HERG的F68C突变影响其PAS区域结构,导致突变体蛋白稳定性降低,突变体蛋白不仅无法正常转运上膜,而且通过负显性效应抑制野生型HERG蛋白上膜,使得HERG通道电流减小,可能是该突变导致LQT2的分子病理机制。