D-塔格糖（tagatose）是一种新型的稀有功能糖,口味与蔗糖类似,其甜度能达到蔗糖的92%左右,但产生的热量却仅为蔗糖的1/3,因此D-塔格糖作为一种新型功能甜味剂成为了人们的研究热点。在绿色生产的要求背景下,生物法转化制备D-塔格糖的需求越来越大。目前,生物法制备D-塔格糖主要途径是:乳糖经β-半乳糖苷酶催化生成D-半乳糖与D-葡萄糖,D-半乳糖再经L-阿拉伯糖异构酶催化生成D-塔格糖。本论文中对上述途径中的两种关键酶进行了制备。分别以枯草芽孢杆菌与多粘类芽孢杆菌KF-1的基因组为模板,利用PCR扩增得到β-半乳糖苷酶基因与L-阿拉伯糖异构酶基因,分别命名为bsβgal与ppoaisol。将bsβgal连接到p ET-28a（+）表达载体上,转入Escherichia coli BL21（DE3）感受态细胞中,并在温度16℃与终浓度0.5 m M IPTG条件下诱导16 h,实现了BSβGal可溶性外源表达。方法同上,使重组PpoAisol在大肠杆菌中实现可溶性外源表达。利用SDS-PAGE确定两种重组蛋白大小约为76 k Da与46k Da,与预测的两种基因片段编码的蛋白质分子量大小基本一致。以对硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷为底物,对纯化的BsβGal的酶学性质进行了研究。最适反应温度为50℃,在20-50℃范围内保温120 min,可保留50%左右活性;最适反应pH为6,在pH 6.0-8.0范围内孵育24 h后可以保留50%以上残留酶活力。测得其Km和Vmax分别为2.56 mmo L/L和5.32μmol/min/mg。通过TLC对BsβGal以乳糖为底物时的反应产物进行定性分析,发现产物为D-葡萄糖与D-半乳糖。以D-半乳糖为底物,对纯化后的PpoAisol的酶学性质进行分析。最适反应温度为50℃,在20-50℃范围内保温120 min,可保留60%以上活性;最适反应pH为7,在pH6.0-9.0范围内孵育24 h后可以保留50%以上酶活力;研究了不同金属离子对重组PpoAisol酶活性的影响,结果显示Mn2+对该酶有显著激活作用,可作为该酶的激活剂,且当Mn2+浓度为0.8 m M时,L-阿拉伯糖异构酶酶活性最高。PpoAisol以D-半乳糖为底物的Km和Vmax的值分别为161.4 mmo L/L和98.84μmol/min/mg,并利用TLC对反应产物进行定性分析,确定产物为目标产物D-塔格糖。对PpoAisol诱导表达条件进行了优化,发现在诱导温度16℃、IPTG浓度0.5 m M和诱导时间16 h表达效果最好。为提高PpoAisol工业应用价值,对游离的PpoAisol采用壳聚糖-戊二醛交联方法进行固定化,并对固定化条件进行了优化。利用单因素试验初步考察了壳聚糖浓度、游离酶添加量、戊二醛浓度、吸附温度和吸附时间对壳聚糖交联固定PpoAisol的影响;通过Plackett-Burman试验筛选出影响壳聚糖交联固定的三个显著因素,分别是壳聚糖浓度、游离酶添加量与戊二醛浓度。为进一步分析三个显著因素之间的相互作用,通过最陡爬坡试验与响应面法得到最佳固定化条件,分别是壳聚糖浓度3.5%、戊二醛浓度3.1%、游离酶添加量0.9 mg/g、吸附温度25℃、吸附时间4 h,在这一条件下固定化率达到80.12%。最后对游离酶与固定化酶的酶学性质进行了比较,结果显示,最适反应温度与最适反应pH都无较大变化,但固定化后酶的热稳定性与pH稳定性都有所提高。以上研究成果为生物法制备D-塔格糖提供了一定的基础。