骨肉瘤(oseteosarcoma,OS)亦称为成骨肉瘤,是一种常见于儿童和青少年的原发性恶性骨肿瘤。好发于长骨干骺端,尤其是近膝关节。总体发病率约4-5/100万。尽管新辅助化疗联合手术综合治疗,已经显著提高了患者的5年生存率[1-6];但是,OS的总体治疗效果仍较差,患者的长期无瘤生存率仍然很低(小于50%)[5]。早期远处转移,尤其是广泛的肺转移是造成骨肉瘤患者死亡的重要原因之一。因此,深入研究骨肉瘤发生、发展过程中相关基因的表达对肿瘤的发生、演变、转归及治疗具有重要意义,这也为骨肉瘤的早期诊断和治疗提供了新的方法和途径。1998年,Kitada等首先报道了常染色体隐性遗传性青少年型帕金森综合征(autosomal recessive juvenile parkinsonism,AR-JP)的致病基因,并将其命名为Parkin[7]。Parkin基因又叫PARK2基因,其广泛存在于人与啮齿动物的各种组织中。PARK2基因的异常表达与多种疾病的发生、发展存在相关性。研究显示:约有30%左右的恶性肿瘤发生了PAR 2基因的表达缺失或下调[8],包括脑胶质瘤、肺癌、肝癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌等[9-14],提示PARK2可能是一个重要的抑癌基因。PARK2基因通过多种信号转转导通路调控肿瘤细胞周期、增殖、侵袭和迁移能力,以及诱导细胞凋亡。当前尚无有关骨肉瘤中PARK2基因在骨肉瘤组织中的表达及其对骨肉瘤细胞生物学行为影响和可能机制研究的相关报道。基于以上原因,本研究拟通过明确PARK2基因在骨肉瘤组织和细胞系中的表达,并以此为依据,进一步构建PARK2基因稳定过表达的骨肉瘤细胞系。通过体外实验深入探讨PARK2基因对骨肉瘤细胞增殖、生长周期、细胞迁移和侵袭等生物学行为的影响,并探索可能的信号通路调控机制;通过体内模型进一步验证PARK2基因对骨肉瘤生长的影响,以期为骨肉瘤的诊断与治疗提供更多理论依据。本研究共分为以下3个部分:(1)PARK2在人骨肉瘤组织标本和细胞系中的表达情况;(2)通过体外、体内实验探索PAPK2基因对人骨肉瘤细胞生物学行为的影响;(3)探索PARK2基因调控人骨肉瘤细胞生物学行为的可能机制。第一章PARK2在人骨肉瘤组织和细胞系中的表达情况目的:探索PARK2蛋白在骨肉瘤和癌旁组织,以及人骨肉瘤细胞系中的表达情况。方法:收集和筛选人骨肉瘤组织和对应癌旁组织标本,进行PARK2蛋白的免疫组织化学染色,观察PARK2蛋白在人骨肉瘤和癌旁组织中的表达,通过免疫组化评分法对每一个样本进行综合评分,分析PARK2在骨肉瘤与癌旁组织中的表达差异;以及PARK2的表达与患者年龄、发病部位、临床分期之间的关系。选择3种人骨肉瘤细胞系(SAOS2、HOS、U20S)和人成骨细胞hFOB1.19,通过RT-qPCR法检测PARK2基因mRNA表达水平,对其结果进行统计分析,揭示正常成骨细胞与人骨肉瘤细胞系中PARK2基因的表达差异,为过表达细胞系的选择提供依据。结果:通过免疫组织化学法染色及评分,PARK2在人骨肉瘤标本中阳性表达率为37%(17/46例);在匹配癌旁组织中阳性表达为76%(35/46例)(P<0.05)。PARK2蛋白的表达与骨肉瘤的临床分期成负相关。在3个骨肉瘤细胞系中PARK2基因的mRNA水平均显著低于其在人成骨细胞hFOB1.19细胞中的表达(P<0.05)。结论:在骨肉瘤中,PARK2基因呈普遍低表达,提示PARK2基因的低表达可能与骨肉瘤的发生发展密切相关。第二章PARK2对人骨肉瘤细胞生物学行为的影响目的:研究目的基因PARK2对人骨肉瘤细胞增殖、生长周期、迁移、侵袭和诱导凋亡能力的影响。方法:选择人骨肉瘤细胞HOS和U2细胞系,通过慢病毒载体构建PARK2表达细胞系(PARK2组)和空载体细胞系(NC组)。通过免疫荧光和Western blot法检测慢病毒载体对人骨肉瘤细胞PARK2基因的过表达效果。本研究以稳定过表达PARK2细胞(PARK2组)和空载体细胞(NC组)为研究对象。1)通过CCK8、平板克隆形成和ki67荧光染色的方法检测PARK2基因对人骨肉瘤细胞增殖能力的影响;利用流式检测法分析PARK2基因对人骨肉瘤细胞周期的影响。2)通过划痕实验、Transwell小室迁移实验和Transwell小室侵袭实验研究PARK2基因对人骨肉瘤细胞迁移、侵袭能力的影响。3)利用Hoechst细胞核荧光染色,和流式细胞仪annexinV-APC/7-AAD双染色法检测PARK2基因对人骨肉瘤细胞凋亡的影响;通过Western blot分析PARK2基因对凋亡相关蛋白表达的影响。4)20只BALB/cnu/nu裸鼠被用于体内实验,选择稳定转染的HOS-PARK2和HOS-NC细胞经胫骨原位种植成瘤(n=10)和经尾静脉注射模拟转移瘤形成模型(n=10),进一步验证PARK2基因在体内对人骨肉瘤细胞生物学行为的影响。结果:HOS和U20S细胞系稳定转染PARK2基因和空载体后,Western blot检测PARK2组Parkin蛋白表达量显著增强;蛋白免疫荧光检测PARK2组细胞荧光强度明显高于NC组。两组细胞的生物学功能分析如下:1)通过HOS和U20S两个细胞系的生长曲线分析可知,与NC组细胞相比,PARK2组细胞增殖速度显著减缓,两组差异有统计学意义(P<0.05);在克隆形成实验中,与对照组相比,PARK2组细胞克隆数及大小明显减少,对50及50个以上的克隆细胞团统计分析,两组差异有统计学意义(P<0.05);Ki67免疫荧光染色显示,PARK2组细胞荧光表达强度明显弱于NC组,计数分析发现,较对照组相比,PARK2组细胞增殖特异性蛋白(ki67)的阳性表达显著下降(P<0.05)。流式细胞周期检测,在HOS细胞系中,与NC组细胞相比,PARK2组细胞进入S期和G2期的细胞比率明显下降(P<0.05)。2)细胞划痕实验和Transwell迁移、侵袭实验显示:较对照组细胞,PARK2组细胞迁移、侵袭能力明显降低(P<0.05)。3)Hoechst细胞核染色可见,PARK2组核异常细胞比率较对照组明显增多(P<0.05);流式细胞仪annexinV-APC/7-AAD双染计数分析,PARK2组细胞凋亡率显著高于NC组细胞(P<0.05);Western blot检测,较对照组相比,PARK2组细胞抗凋亡蛋白Bcl-2表达减弱,凋亡蛋白caspase3表达增强,尤其是激活状态的凋亡蛋白cleaved caspase 3表达明显上调。4)裸鼠胫骨原位成瘤模型显示:3周后,PARK2组胫骨肿瘤体积较NC组瘤体积更小(P<0.05),HE染色发现在骨反应区域可见血细胞及血管官腔样结构,与对照组相比,PARK2组明显减少;尾静脉肺内转移模型显示:PARK2组裸鼠肺内转移瘤灶明显少于对照组(P<0.05),且转移瘤体积也较对照组小。结论:PARK2基因可以影响人骨肉瘤细胞的生长周期,同时减弱细胞的增殖能力,抑制人骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力,诱导细胞发生凋亡,从而延缓骨肉瘤在体内的生长和减少转移的发生;其可能是通过抑制新生血管形成来抑制完成上述生物学行为的。第三章PARK2调控人骨肉瘤细胞生物学行为的可能机制目的:探索PARK2基因对血管相关信号转导通路JAK2/STAT3/VEGF的影响。方法:选择稳定转染的PARK2组和NC组细胞。通过Western blot和蛋白免疫荧光法检测两组细胞JAK2/STAT3/VEGF通路相关蛋白的表达情况;加用通路相关激活剂(IL-6)和抑制剂(stattic)激活或抑制该通路后,体外观察细胞小管形成能力和相应蛋白的表达变化情况;5只BALB/cnu/nu裸鼠被用于体内成血管模型,取相同数量的HOS-NC细胞和HOS-PARK2细胞分别种植于裸鼠的左侧和右侧腹股沟区,加以验证PARK2基因对人骨肉瘤新生血管形成的影响。结果:Western blot法检测发现:与对照组相比,PARK2组p-JAK2、p-STAT3和VEGF蛋白表达显著下降。蛋白免疫荧光检测可见PARK2组细胞磷酸化STAT3和VEGF蛋白的荧光表达强度较NC组弱,且p-STAT3细胞核内表达明显减少。体外小管形成实验显示:PARK2组细胞小管形成能力较对照组下降,IL-6和stattic可以显著激活或抑制骨肉瘤细胞的小管形成能力和调节p-JAK2、p-STAT3、VEGF蛋白的表达。体内新生血管形成实验可见腹股沟血管与骨肉瘤细胞-基质胶体连通,可见基质胶体内血管分布;与对照组相比,PARK2组基质胶体内血管分布较少,两组血红蛋白定量分析,差异有统计学意义;基质胶体切片、免疫荧光分析显示:单个视野范围内PARK2组中CD34阳性表达率较对照组少。结论:PARK2基因通过JAK2/STAT3/VEGF信号转导通路抑制人骨肉瘤血管形成,进而下调细胞增殖、迁移和侵袭等生物学功能。