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嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)是一种遗传稳定的乳酸菌,在食品加工、农业生产以及益生菌行业已得到广泛应用。然而,它在工业生产过程中常面临酸胁迫的威胁,严重影响其生长性能。嗜酸乳杆菌能将碳水化合物转化为乳酸快速酸化其生长环境,乳酸的累积对细菌有抑制作用;它将导致细胞内p H值、新陈代谢和生长速率下降,从而对发酵过程及益生菌培养物的活力或浓度带来负面影响。此外,作为益生菌,嗜酸乳杆菌在胃肠道运输时常遭受酸压力,它必须在酸性胃液环境中生存才能到达小肠并定居在宿主体内,从而发挥其益生功效。考虑到酸胁迫对嗜酸乳杆菌的影响,本研究旨在采用常压室温等离子体诱变结合适应性进化策略选育对乳酸胁迫具有较高耐受性的嗜酸乳杆菌益生菌株。主要研究结果如下:(1)利用常压室温等离子体诱变(Atmospheric and Room Temperature plasma,ARTP)结合适应性进化(Adaptive Laboratory Evolution,ALE)提高L.acidophilus的耐酸性。结果表明:60s为ARTP最佳暴露时间,存活率为5.91%。经ARTP和ALE处理的突变株LAartp-ale2在p H 3.0和2.5下培养3 h后,乳酸耐受性增强,存活率分别为75.67%和25.78%。生理分析结果表明,酸胁迫下,ARTP-ALE突变株LAartp-ale2比亲本菌株具有更低的膜通透性。此外,为响应乳酸诱导形成的酸胁迫,LAartp-ale2产生更多的生物膜,且在p H2.5时相比于出发菌株(76.2%)具有更高的疏水性,为87.2%。LAartp-ale2表现出较高的不饱和脂肪酸(UFA)与饱和脂肪酸(SFA)的比例,以此影响细胞膜的物理状态、提高其在p H 3.0和2.5的存活率。综上所述,ARTP结合ALE是一种增强L.acidophilus耐酸性的有效方法,具有潜在的工业应用价值。(2)L.acidophilus在乳酸诱导应激条件下的存活情况取决于酸应激基因的表达,因此本研究在转录水平分析其酸耐受响应机制(Acid tolerance response,ATR)。采用实时荧光定量PCR技术(q RT-PCR)来确定其与ATR相关的基因表达情况,结果表明,在涉及细胞膜变化、能量生产、细胞代谢、I类应激反应途径和细胞信号转导的ATR机制中,基因的调控不同。酸胁迫下,亲本和突变株LAartp-ale2基因pls X、slp X、atp C、gad C、lux S和dna K的表达量均上调;有趣的是,突变株LAartp-ale2以上6个基因的表达量显著高于出发菌株,这在一定程度上解释了其耐酸性的提高。(3)最后,利用耐酸性益生L.acidophilus LAartp-ale2对豆粕进行固态发酵被认为是提高豆粕总体营养价值的有效方法。使用正交设计对发酵过程进行优化,研究接种量、水分含量、时间及温度四个因素对发酵的影响。结果表明,L9(34)正交设计确定的提高豆粕中酸溶性蛋白、粗蛋白及蛋白酶活性的最佳发酵条件为:接种量6%、水分含量80%、发酵时间5d、发酵温度37℃。此条件下,发酵豆粕中酸溶性蛋白含量14.10%,粗蛋白含量61.77%,蛋白酶活性155.87μ/g。