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目的:牙周炎与糖尿病的双向关系已经被广泛认可,小分子RNAs(microRNAs,miRs)对牙周炎和糖尿病的发生发展均存在调节作用,但是,在伴糖尿病的牙周炎的发病机制中miRs作用机制尚不明确。本研究旨在通过体外细胞实验,在高糖状态下检测人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts,HGFs)中miR-126及相关基因表达水平的变化;转染miR-126 mimic后检测miR-126对HGFs分泌炎性细胞因子的影响;通过生物信息学筛选和分析miR-126靶基因,探索在高糖刺激下HGFs中miR-126的调节通路,阐明其在糖尿病对牙周炎的影响中的作用和调控机制,为探索治疗伴糖尿病的牙周炎新方法提供依据。方法:1.经患者知情同意后,在全身健康的患者拔除埋伏阻生第三磨牙时收集健康的牙龈组织,放入含有1%双抗的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)缓冲液中冲洗3遍,将牙龈组织剪碎成约1 mm3的小块,采用组织块贴壁法体外培养HGFs,通过倒置相差显微镜观察其形态及生长情况。2.分别用低糖(5.5 mmol/l)、中糖(15 mmol/l)和高糖(25 mmol/l)处理HGFs,体外培养12 h、24 h和72 h后实时荧光定量聚合酶链式反应(real time polymerase chain reaction,real time PCR)检测miR-126、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNFα)、化学趋化因子配体2(chemical chemokine ligand 2,CCL2)、IL-10的表达水平变化。3.miR-126 mimic转染HGFs,检测转染效率。转染后用低糖、中糖和高糖刺激,提取细胞总RNA,用real time RCR检测上述基因的表达变化;提取细胞总蛋白进行蛋白免疫印迹实验。4.miR-126 mimic转染HGFs后,用低糖、中糖和高糖刺激,收集培养液上清进行酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA),检测上述炎症因子的蛋白水平。5.通过生物信息学分析miR-126靶基因,筛选预测值高的可能靶基因进行验证。6.通过双荧光素酶报告基因实验,验证此基因是否为miR-126的直接靶基因,并检测其结合位点。结果:1.采用组织块贴壁法成功培养出HGFs,传代后细胞趋于一致的长梭形并呈放射状、旋涡状排列,生长旺盛。2.随着培养基糖浓度升高,HGFs中IL-6、TNFα、CCL2的mRNA表达水平升高,IL-10的mRNA表达水平降低。3.随着培养基糖浓度升高,分别在12 h、24 h和72 h时HGFs中miR-126表达显著降低(P<0.05),筛选出的可能靶基因TRAF6表达显著升高(P<0.05),两者呈相反趋势。4.miR-126 mimic转染HGFs后,real time PCR结果表明miR-126表达相应显著升高(P<0.05);TRAF6的mRNA水平和蛋白质水平都显著降低(P<0.05);双荧光素酶报告基因实验证明TRAF6是miR-126的直接靶基因,其结合位点在TRAF6的3’-非编码区(3’-untranslated region,3’-UTR)第348-354个碱基位点处。5.miR-126 mimic转染HGFs后,real time PCR结果表明IL-6、TNFα、CCL2的mRNA表达水平显著降低,IL-10显著升高(P<0.05);ELISA结果显示HGFs分泌的IL-6、TNFα、CCL2和IL-10与real time PCR结果趋势相一致。结论:1.高糖降低HGFs中miR-126的表达水平。2.miR-126通过靶向TRAF6,抑制HGFs分泌炎性细胞因子。3.miR-126作为保护性因子,有望成为治疗伴糖尿病的牙周炎的靶位点。