植物RNA病毒载体表达系统是一种有潜力的外源基因瞬时表达平台,生物安全性是阻碍其应用的瓶颈问题之一。Ⅰ型启动子具有的种属间特异性,理论上可以缩小重组病毒的宿主范围降低病毒载体潜在的生物危害性。Ⅰ型启动子已被广泛应用于动物病毒载体的研究中,但在植物中却鲜有报道。植物Ⅰ型启动子能否像哺乳动物Ⅰ型启动子一样,高效地提高病毒载体的生物安全性仍有待验证。鉴于此,本论文以番茄丛矮病毒(Tomato bushy stunt virus,TBSV)为实验材料,构建本氏烟Ⅰ型启动子介导转录的TBSV病毒表达载体,通过分析接种叶片中重组GFP表达情况,探索本氏烟Ⅰ型启动子顺式调控序列、转录特性和Ⅰ型终止子对病毒载体的影响,初步明确Ⅰ型启动子介导转录的植物病毒载体表达系统的有效性和主要特征。研究发现,①本氏烟Ⅰ型启动子长度对启动子转录频率和病毒载体的表达水平无显著影响;长度仅为77 nt的启动子就可以起始病毒基因组RNA的转录;并且其启动子结构中不存在类似于动物Ⅰ型启动子的上游控制元件(Upstream control element,UCE);②启动子转录起始位点上游T串序列以及转录起始位点核苷酸A/G互换也对启动子转录频率和病毒载体的表达效率无显著的影响;③转录起始位点下游延伸序列(延伸至+42位)对启动子转录强度具有显著的正调控作用,能够通过增强启动子转录频率提高病毒载体表达水平,效果增幅约为2倍;④源于35S启动子的ELS序列(Enhancer-like sequence)能够增强启动子转录频率和提高病毒载体表达水平3-5倍;修改后的本氏烟Ⅰ型启动子具有与35S启动子相似的转录强度;⑤本氏烟Ⅰ型启动子具有转录的非专一性,这一转录特征与转录起始位点下游延伸序列和ELS序列无关,是其自身固有的特性。受体本氏烟中的Pol Ⅱ对Ⅰ型启动子的非特异性识别是其非特异性转录产生的可能原因;⑥对本氏烟Ⅰ型启动子TATA框中的单碱基进行突变,可以在不影响Ⅰ型启动子转录效率的情况下,一定程度上提高了其转录的专一性。但是,依然不能完全杜绝受体细胞PolⅡ对Ⅰ型启动子的非特异性识别和转录;⑦Ⅰ型终止子既不能提高病毒载体的表达水平,也不能提高本氏烟Ⅰ型启动子的转录专一性,且其存在与否不会影响病毒载体的表达效率。推测TBSV病毒对其3’末端的高水平修复是产生这一结果的可能原因。相关研究初步建立起以RNA聚合酶Ⅰ介导转录植物病毒表达系统,为进一步探索Ⅰ型启动子介导的植物病毒表达系统在生物安全性上的潜力以及其在实际应用中的潜能和应用前景等奠定了基础。