【摘 要】
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[目的]家族性腺瘤样息肉病（familial adenomatous polyposis,FAP）为常见的遗传性结直肠癌综合征,该类患者在所有遗传性结直肠癌中预后差,典型的FAP其癌变平均年龄在40岁以下,严重威胁人类健康。而FAP目前无较好的治疗方式,只能大范围手术切除病灶,恶变患者术后易复发、转移,严重影响生存质量。APC基因的突变和功能丢失是FAP发生的关键机制,本研究前期发现APC基因新的
【基金项目】
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国家自然科学基金（81660472）；
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[目的]家族性腺瘤样息肉病（familial adenomatous polyposis,FAP）为常见的遗传性结直肠癌综合征,该类患者在所有遗传性结直肠癌中预后差,典型的FAP其癌变平均年龄在40岁以下,严重威胁人类健康。而FAP目前无较好的治疗方式,只能大范围手术切除病灶,恶变患者术后易复发、转移,严重影响生存质量。APC基因的突变和功能丢失是FAP发生的关键机制,本研究前期发现APC基因新的突变位点可能与FAP的发生密切相关,本研究旨在通过CRISPR/Cas9基因编辑技术优势,构建携带APC基因突变的FAP小型猪模型,并构建稳定细胞株,通过细胞增殖及细胞周期检测等功能实验评估APC基因突变对细胞功能的影响,为后期机制探索提供动物和细胞模型,有助于预测人类FAP症状出现前的基因诊断模型及早期干预模式,为FAP家系管理、遗传咨询、治疗决策提供实验依据。[方法]1.制定两种APC基因突变方案:一是APCE15（第15号外显子区域）基因功能失活;二是敲除APC基因上的特定“aa”片段,使特定的功能蛋白不能与之结合,最终导致下游的β-catenin表达增加；2.收集滇南小耳猪近交系的猪胚胎组织进行细胞分离和培养,获得符合条件的猪胚胎原代成纤维细胞;3.根据拟定的两种基因突变方案,设计7对靶向APC基因15号外显子的单一导向RNA,构建包含gRNA和Cas9蛋白质粒;通过T7E1酶切选取有切割效率的sgRNA;4.通过电转染的方式将gRNA/Cas9重组质粒转至猪胚胎成纤维细胞,利用单克隆筛选和鉴定的方式,获取含有目的突变片段的单克隆细胞;构建APC基因片段混合敲除的猪成纤维细胞系;5.利用体细胞核移植技术（SCNT）将供体细胞系完整注射到成熟的去核卵母细胞中,通过电击方式完成卵母细胞融合和激活,挑取融合良好的重构胚胎待移植;6.通过破腹手术方式将构建好的重构的存活胚胎,置入代孕母猪输卵管中;B超确认妊娠情况,取其中一只克隆猪胎提取基因组DNA进行基因型和性别鉴定；7.通过MTT法、流式细胞术对基因编辑后猪胎成纤维细胞（APC-/+组）和野生型原代成纤维细胞（WT组）进行对照观察APC基因突变对细胞增殖、分化情况影响。通过细胞爬片免疫组化和Western-blot方法验证APC-/+细胞蛋白表达情况。[结果]1.本研究利用CRISPR/Cas9系统制备基因敲除猪模型,在猪APC基因的第15外显子上设计了 7个sgRNA。我们选取酶切效率较高的sgRNA3、sgRNA4重组质粒,获得10个细胞系,经DNA检测目标序列敲除情况后,选取8号、10号细胞系为核供体,形成重构胚胎。挑取已经卵裂的形态好的胚胎进行胚胎移植,将其分批次移植于4头发情期受体母猪输卵管中,手术移植胚胎,第30天时B超下见其中一头母猪妊娠,怀有3枚猪胚胎。2.在猪怀孕32天时剖腹取得一枚猪胎,经测序鉴定其为APCaa单敲除的雄性猪胎,在目标序列有113bp的敲除,随后用该猪胎组织建立稳定的APC-/+成纤维细胞系。3.用基因编辑致APC基因突变的成纤维细胞系（APC-/+）和未编辑的猪胎原代成纤维细胞系（WT野生型）进行体外增殖实验,MTT法绘制生长曲线显示APC-/+成纤维细胞增殖明显。流式细胞周期检测:APC-/+组细胞处于G0/G1期较WT组的细胞数少,APC-/+组细胞处于S期的细胞较多,差异有统计学意义。4.我们对野生型和编辑后APC-/+成纤维细胞行细胞爬片,固定并检测,结果提示,野生型细胞中无明显β-catenin表达,然而APC-/+细胞中可见其显著表达。[结论]1.本研究获得了 APC（E15）双敲除和APCaa双敲除和单敲除的3种细胞系可供移植;3种细胞系核移植后只有APCaa单敲除的猪胚胎存活。2.通过细胞功能学验证APC基因该位点突变后细胞增殖明显。
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