miR-133b-3p靶向调控P2X4R介导卒中后中枢痛的发生

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目的:1.建立大鼠卒中后中枢痛(Central post-stroke pain,CPSP)模型,检测丘脑腹后外侧核(ventral posterolateral nucleus,VPL)区小 RNA(microRNA,miRNA)及嘌呤能P2受体(P2X4R)蛋白的差异表达;2.明确miR-133b-3p是否以p2rx4 mRNA为作用靶点调控P2X4R的表达;探讨过表达miR-133b-3p对CPSP大鼠疼痛行为的影响;3.探究加巴喷丁对CPSP大鼠miR-133b-3p水平及疼痛行为的影响。方法:1.采用丘脑腹后外侧核自体血注射方法建立大鼠CPSP模型;采用Von frey纤维针检测大鼠左足机械痛阈值;利用生物信息学软件预测与大鼠p2rx4基因相关的miRNA,聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)分析 CPSP 大鼠丘脑 miRNA的差异表达;蛋白免疫印迹法(Western blot,WB)检测CPSP大鼠丘脑腹后外侧核区P2X4R的差异表达;2.构建双荧光素酶报告基因验证miR-133b-3p与p2rx4 mRNA的作用位点;在CPSP大鼠丘脑处注射慢病毒过表达miR-133b-3p,观察大鼠左足机械痛阈值变化,两周后检测大鼠丘脑组织、脑脊液及血液中miR-133b-3p水平以及丘脑P2X4R的差异表达;3.将成功造模的CPSP模型大鼠随机分为四组,分别为对照组、加巴喷丁组、加巴喷丁+miR-133b-3p inhibitor 组、加巴喷丁+mismatch inhibitor组。加巴喷丁组予连续14天腹腔注射加巴喷丁(100mg/kg);对照组予连续14天腹腔注射同等剂量生理盐水;加巴喷丁+miR-133b-3p inhibitor组在连续14天腹腔注射同等剂量加巴喷丁同时,在丘脑腹后外侧核注射慢病毒包被的miR-133b-3p抑制剂;加巴喷丁+mismatch inhibitor组在连续14天腹腔注射同等剂量加巴喷丁同时,在丘脑腹后外侧核注射注射慢错配病毒。观察各组大鼠左足机械痛阈值变化,两周后检测各组大鼠丘脑组织、脑脊液及血液中miR-133b-3p的表达水平以及丘脑P2X4R的表达。结果:1.CPSP大鼠丘脑P2X4R蛋白和miRNA的表达变化:(1)与对照组相比,CPSP大鼠造模7天后左足机械痛阈明显降低(p<0.001);(2)与对照组相比,CPSP大鼠丘脑腹后外侧核区P2X4R表达增加(p<0.05);(3)生物学信息预测筛选出最有可能靶向大鼠p2rx4基因的miR-133a-3p和miR-133b-3p,PCR结果示与对照组相比,CPSP大鼠脑组织中miR-133a-3p表达无统计学差异(p>0.05),而丘脑组织、脑脊液及血浆中miR-133b-3p均表达下调(均为p<0.001)。2.双荧光素酶报告实验显示miR-133b-3p与p2rx4 mRNA的靶向调节作用:与对照组相比,转染了 miR-133b-3p模拟物对构建的野生型p2rx4载体的荧光表达有一定的下调作用(p<0.001),突变型p2rx4载体的报告荧光与对照组相比无统计学差异(p>0.05)。3.过表达miR-133b-3p对CPSP大鼠疼痛行为的影响:与对照组相比,在丘脑注射慢病毒过表达miR-133b-3p两周后,CPSP大鼠左足机械痛阈值升高(p<0.001),同时脑组织、脑脊液及血液中miR-133b-3p表达增加(均为p<0.001),丘脑腹后外侧核P2X4R表达降低(p<0.05)。4.加巴喷丁对CPSP大鼠miR-133b-3p水平及疼痛行为的影响:(1)与对照组相比较,CPSP大鼠连续14天腹腔注射加巴喷丁后,左足机械痛阈值升高(p<0.05),大鼠脑组织、脑脊液及血液中miR-133b-3p均表达增加(均为p<0.001),同时丘脑P2X4R 表达下降(p<0.05);(2)与加巴喷丁+mismatch inhibitor 组相比,CPSP 大鼠予加巴喷丁治疗同时在丘脑腹后外侧核注射miR-133b-3p抑制剂后,大鼠左足机械痛阈降低(p<0.05),加巴喷丁改善疼痛作用被逆转,同时脑组织、脑脊液及血液中miR-133b-3p水平下降(均为p<0.001),丘脑P2X4R表达增加(p<0.05)。结论:1.大鼠丘脑注射自体血可成功诱导卒中后中枢痛模型;CPSP大鼠丘脑腹后外侧核P2X4R表达增加,脑组织、脑脊液及血液miR-133b-3p表达下调。2.miR-133b-3p以p2rx4 mRNA的3’UTR区为靶点调控P2X4R蛋白表达;过表达miR-133b-3p可以逆转CPSP大鼠的疼痛行为。3.加巴喷丁可能通过上调miR-133b-3p抑制P2X4R的表达改善CPSP大鼠疼痛行为。
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