目的:支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)的病理特征主要为肺泡化阻滞,具体表现为次级分隔缩短、肺泡数目减少、体积增大及结构简单化等,提示BPD的发生与肺泡发育过程受阻或停滞有关。在肺泡化过程中,次级分隔将囊泡分隔、重塑成肺泡,而定位在次级分隔顶端的肌成纤维细胞分泌弹性蛋白等基质成分,促进次级分隔延伸、成熟。胎儿未成熟的肺暴露于宫内炎性环境中,是早产儿出生后发生BPD的重要危险因素。我们前期研究认为LPS诱导TGF-α过表达,通过EGFR受体传递信号,干扰了肌成纤维细胞的定向迁移,使其不能正确定位到次级分隔顶端,导致肺泡化过程受阻。在此基础上,我们接下来的工作将进一步深入研究肺肌成纤维细胞是通过怎样的胞内信号传导机制来响应LPS的。方法:第一部分:细胞要定向迁移首先要发生极化,因此我们推测LPS可能通过干扰肺肌成纤维细胞的极化,进而影响细胞的定向迁移。在本研究中,我们用高尔基体极性实验以及transwell细胞迁移实验分别来研究LPS对肌成纤维细胞的极化和定向迁移的影响。我们的前期研究认为LPS是通过TGF-α/EGFR信号通路干扰肺肌成纤维细胞的定向迁移的,所以接下来我们用外源性TGF-α即rhTGF-α刺激肌成纤维细胞,以观察其是否如我们预料的也会影响肌成纤维细胞的极化和定向迁移,并用EGFR受体抑制剂AG1478作用于肌成纤维细胞,验证LPS是否通过TGF-α/EGFR信号通路干扰肺肌成纤维细胞的极化和定向迁移;第二部分:首先通过Western blots实验检测LPS是否通过TGF-α/EGFR信号通路对肌成纤维细胞RhoA的活性产生影响,然后进一步用RhoA下游通路ROCK抑制剂Y27632预处理肌成纤维细胞,研究LPS引起的RhoA活性改变是否影响肌成纤维细胞的极化和定向迁移;第三部分:14-3-3β与细胞骨架重构及细胞迁移等生理活动密切相关,且可以跟GAPs结合,进而调节RhoA活性。我们通过转染14-3-3βsiRNA抑制肌成纤维细胞中14-3-3β的表达,然后研究LPS是否依然可以影响肌成纤维细胞RhoA的活性以及肌成纤维细胞的极化和定向迁移。结果:第一部分:结果显示,相较于对照组,LPS和TGF-α明显干扰了肌成纤维细胞的极化(高尔基体极化的比例:60.03±0.22 vs 41.90±0.87,p<0.01;59.37±0.8762 vs 42.73±0.4410,p<0.01),而且影响了肌成纤维细胞的定向迁移(迁移通过transwell的细胞数目:37.80±1.66 vs 20.80±1.11,p<0.01;37.80±1.65 vs25.20±0.9,p<0.01)。用AG1478预处理后,可部分阻断LPS和TGF-α对肌成纤维细胞的极化和定向迁移的影响;第二部分:Western blots结果显示,LPS和TGF-α明显上调肌成纤维细胞RhoA的活性,而EGFR抑制剂AG1478预处理后可阻断LPS和TGF-α诱导的RhoA激活。然后我们用Y27632阻断RhoA的下游通路后,可以改善LPS和TGF-α对肌成纤维细胞的极化和定向迁移的干扰;第三部分:Knock down 14-3-3β后,可以部分阻断LPS和TGF-α对肌成纤维细胞RhoA的激活作用,改善对肌成纤维细胞极化和定向迁移的影响。结论:通过以上的结果,我们建立了一个新的分子机制,来解释LPS是通过怎样的信号通路而干扰肌成纤维细胞的定向迁移。具体的说就是LPS通过TGF-α/EGFR激活RhoA,而14-3-3β作为GAPs的一个配体在这一过程中是必不可少的,RhoA活性上调通过干扰肌成纤维细胞的极化而影响他们的定向迁移,进而引起肺肌成纤维细胞不能正常定位到次级间隔的顶端而导致BPD肺泡化阻滞。