丁香假单胞菌丁香致病变种1336(Pseudomonas syringae pv.Syringae Van Hall 1336)是一种重要的植物致病菌,其寄主范围广,可以侵害多种木本植物和草本植物的枝、叶、花和果,导致植物产生病变。其毒性与Ⅲ型分泌系统的效应蛋白有关。前期实验研究发现磷脂酰胆碱合酶(PCS)途径是丁香假单胞菌丁香致病变种1336合成磷脂酰胆碱(PC)的唯一途径。在将磷脂酰胆碱合酶基因pcs敲除后,pcs~-缺失突变体无法合成磷脂酰胆碱,缺失磷脂酰胆的丁香假单胞菌丁香致病变种几乎丧失致病能力。而该致病能力的丧失与Ⅲ型分泌系统(T3SS)的功能紧密相关。磷脂酰胆碱缺失对细菌毒性的影响,可能存在的机制有(1)磷脂酰胆碱影响Ⅲ型分泌系统相关基因的表达,(2)磷脂酰胆碱影响Ⅲ型分泌系统相关蛋白从细胞质向细胞膜上转运及在膜中组装,(3)磷脂酰胆碱影响Ⅲ型分泌系统相关蛋白在膜中的拓扑结构。为了探究磷脂酰胆碱的缺失对Ⅲ型分泌系统的功能影响的分子机制,拟从转录水平、翻译水平、转运水平比较Ⅲ型分泌系统相关蛋白在P.syringae pv.syringae van Hall 1336野生型和突变型中的差异。早前实验室在对syringae pv.syringae van Hall 1336野生型和突变型中Ⅲ型分泌系统相关基因转录水平表达量的研究中发现,磷脂酰胆碱缺失不影响Ⅲ型分泌系统相关基因在转录水平上的表达。因此,本研究主要对与Ⅲ型分泌系统组件蛋白的基因进行克隆,表达和纯化,制备多克隆抗体,然后通过蛋白免疫印迹(Western blotting)分析,比较Ⅲ型分泌系统组件蛋白在野生型和pcs~-突变型细胞质和细胞膜上表达量的差异,探索磷脂酰胆碱影响Ⅲ型分泌系统的分子机制。在实验室前期工作的基础上,完成了与T3SS相关的4个基因的克隆并成功构建了原核表达载体,表达并纯化了7个蛋白,成功制备了7个多克隆抗体,完成了与T3SS装置相关的13个蛋白的蛋白印迹分析。在使用Western blot方法对Ⅲ型分泌系统装置中的13个组件蛋白进行分析,结果发现(1)在1336野生型和1336 pcs~-突变型的胞质蛋白中,12个组件蛋白的含量没有显著性差异,仅在野生型胞质蛋白中HrpR蛋白稍多于1336 pcs~-突变型;(2)与野生型相比,1336 pcs~-突变型中HrpB,HrpE,HrpJ和HrpR蛋白的含量呈显著性减少,其余9个蛋白在膜上的含量无显著性差异。1336 pcs~-突变型细胞膜中较少的Hrp B,HrpE,HrpJ和HrpR蛋白暗示磷脂酰胆碱的缺失可能影响蛋白质从细菌细胞质到细菌膜的转运。