MicroRNAs(miRNAs)是由长度约21～25个核苷酸序列的RNA分子组成的,是哺乳动物和植物中基因转录后调控的关键因子,并且彻底改变了我们对基因转录后调控的理解。目前研究发现大部分动物中的miRNA能够通过种子序列与靶基因mRNA的3’端非翻译区(3’UTR)序列以不完全配对的方式结合,通过抑制翻译或者促进mRNA脱腺苷化和降解从而抑制蛋白质的合成。在哺乳动物中,预测有50%左右的蛋白编码基因的活性是受miRNA控制的。口前的功能研究显示miRNA几乎参与每个细胞的调控过程,并且miRNA表达的改变可能参与很多人类的疾病过程。有研究表明,miRNA在生物体内是呈组织特异性分布的,而神经系统与其他的组织一样也表达miRNA,并且有些miRNA是仅表达于神经组织或神经细胞的,比如miR-9,miR-124a,miR-125,miR-128以及miR-129。miR-124a在分化中和成熟的神经元中均表达,是脑组织中含量最高的miRNA,大约占大脑miRNA总量的25～48%,并且其核苷酸序列在物种间高度保守。以往对于miR-124a的研究大多是探索其在神经发生方面的作用,但是作为神经系统中表达最丰富的miRNA,其在神经发育方面的作用还鲜为人知。最近的研究发现,miR-124a可能通过调节细胞骨架的活动从而影响神经突起的形成,但是miR-124a对于神经突起生长调节作用的直接靶基因目前仍然未知。氧化固醇结合蛋白(oxysterol-binding protein,OSBP)和OSBP相关蛋白(ORPs)在真核生物中构成一个保守的固醇和磷脂酰肌醇结合蛋白家族,ORPs蛋白家族的作用机制到目前为止还不完全清楚。然而,一些ORPs蛋白存在于膜接触位点并且控制与信号转导、囊泡转运和脂质代谢相关的酶效应器或者蛋白复合物的活性。哺乳动物中的ORPs蛋白功能包括协调固醇和鞘磷脂代谢以及促有丝分裂信号(OSBP),控制内质网-晚期核内体(LE)接触和LE的能动性(ORP1L),中性脂质代谢(ORP2),细胞粘附(ORP3),巨噬细胞脂质平衡、迁移和高密度脂蛋白代谢(ORP8),载脂蛋白B-100分泌(ORP10)和脂肪细胞分化(ORP11)等。但是越来越多的ORPs相互作用蛋白已经被确定,这提示它们可能涉及细胞调节的多个方面,与ORPs相互作用的蛋白质,功能包括细胞信号传导、囊泡运输、脂代谢、糖代谢、细胞骨架调节蛋白、离子转运等。因此,ORPs可以通过与不同的配体结合,在有机体内发挥相应的功能。ORPs蛋白家族的不同成员的表达量是具有组织特异性的,ORP1在人的大脑皮层有着较高的转录水平,并且在培养的人成神经细胞瘤细胞系中显示出固醇调节的表达。因此,包括OSBP在内的ORPs家族蛋白可能对中枢神经系统细胞的固醇平衡起着重要作用。人的OSBP蛋白能够作为胆固醇结合支架蛋白从而协调两种磷酸酶[丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(serine/threonine phosphatase,PP2A),酪氨酸磷酸酶(tyrosine phosphatas,HePTP)]的活性来控制细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)信号通路,另外,研究发现ERK的磷酸化能够促进神经突起的生长,但是OSBP对神经突起生长的作用仍然未知。基于目前的研究现状,我们一方面致力于探索miR-124a促进神经突起生长的靶基因,另一方面试图寻找其中的作用机制。为了找到miR-124a可能的靶基因,我们首先利用在线生物信息学软件(TargetScan)对miR-124a的靶基因进行预测,然后结合相关的文献资料对预测出的候选基因进行筛选。结果我们发现OSBP基因的3’UTR有3个保守的miR-124a作用位点并且将其作为候选基因进行研究。接下来为了验证miR-124a是通过种子序列与候选基因OSBP 3’UTR相互作用的,我们先从Genbank网站上获取OSBP的3’UTR(小鼠来源)全长序列,然后通过软件Primer Premier 6.0设计出PCR引物序列,以N2a细胞基因组DNA为 PCR 模板,构建 miR-124a 表达质粒 hU6-miR-124a-CMV-EGFP(简称 U6-124),以U6-124质粒为模板构建miR-124a突变质粒hU6-miR-124amut-CMV-EGFP(简称U6-124mut),将AAGG突变成TTCC。利用包含miR-124a所有作用位点的OSBP3’UTR构建荧光素酶报告基因质粒(OSBP3’UTR),以OSBP3’UTR质粒为模板构建OSBP 3’UTR突变质粒(OSBP 3’UTRmut),将GCCT突变成CGGA。接着我们用脂质体转染试剂LipofectamineTM2000将质粒共转染HEK293细胞进行荧光素酶报告基因检测实验,实验分两组,一组是OSBP 3’UTR质粒分别与U6-124质粒、U6-124mut质粒、对照质粒U6共转染293细胞;另外一组是OSBP 3’UTRmut质粒分别与U6-124质粒、U6-124mut质粒、对照质粒U6共转染293细胞,转染24h后用Dual-Luciferase(?)Reporter Assay System试剂盒检测海肾荧光素酶活性,以双荧光载体中的萤火虫报告基因的荧光活性作为转染内参。结果OSBP 3’UTR质粒与U6-124mut质粒共转染组的荧光素酶活性[(93.97± 10.19)%]显著高于OSBP 3’UTR质粒与U6-124质粒共转染组[(50.63±9.58)%,n=4,P=0.009],OSBP 3’UTRmut质粒与U6-124质粒共转染组的荧光素酶活性[(80.19±10.56)%]显著高于OSBP 3’UTR质粒与U6-124质粒共转染组[(50.63±9.58)%,n=4,P=0.005],差异有统计学意义,而OSBP3’UTR质粒与对照质粒U6共转染组的荧光素酶活性[(100.00±8.78)%]和OSBP 3’UTR质粒与U6-124mut质粒共转染组[(93.97±10.19)%,n=4,P=0.936]之间差异无统计学意义,提示miR-124a可以通过与OSBP基因3’UTR区序列特异性结合抑制其表达,这提示我们OSBP可能是miR-124a的直接靶基因。为了进一步验证miR-124a能够抑制OSBP基因的表达,我们用脂质体转染试剂LipofectamineTM2000将miR-124a过表达质粒U6-124和对照质粒U6分别转染293细胞,96h后提取细胞总蛋白,用western blot实验检测OSBP蛋白表达水平的变化。结果显示与转染对照质粒U6组相比,转染U6-124质粒组能够显著地降低OSBP的蛋白表达水平,进一步证明miR-124a抑制OSBP基因的表达。接下来我们用终浓度为20μmol/L的视黄酸诱导N2a细胞分化模型来验证miR-124a在神经突起生长中的作用,细胞诱导分化24h后用荧光显微镜观察细胞形态。结果显示转染miR-124a过表达质粒U6-124组的细胞突起长度(n=24,146.82±19.06)明显高于对照质粒 U6 组(n=20,98.31±19.53,P<0.001),长出神经突起大于两倍胞体长的细胞占总细胞数量的百分比[n=24,(45.23±7.65)%]也明显高于对照组[n=20,(11.11±5.05)%,P<0.001],差异有统计学意义。说明在N2a细胞分化过程中,miR-124a具有明显的促进神经突起生长的作用。为了探究OSBP基因对神经突起生长的作用,我们采用了 shRNA介导基因沉默的方法。参考文献上证明有效的RNA干扰序列,,委托上海吉玛公司构建OSBP 基因的 shRNA 干扰质粒 pGPU6-shOSBP-CMV-GFP(简称 shOSBP),利用脂质体转染试剂LipofectamineTM2000将shOSBP质粒和对照质粒shcontrol分别转染N2a细胞,用终浓度为20μmoI/L的视黄酸诱导分化48h后用荧光显微镜观察细胞形态。结果显示转染shRNA干扰质粒shOSBP组的细胞突起长度(n=34,189.03±68.47)明显高于对照质粒 shcontrol 组(n=40,134.81±36.27,P<0.001),突起大于两倍胞体长的细胞占总细胞数量的百分比[n=35,(40.26±10.79)%]也明显高于对照组[n=41,(16.13±6.32)%,P<0.001],差异有统计学意义。说明在N2a细胞分化过程中,OSBP基因能够明显的抑制神经突起的生长。为了进一步研究OSBP基因对神经突起生长的作用,我们从Genbank网站上获取候选基因OSBP的mRNA(小鼠来源)全长序列,然后通过软件Primer Premier 6.0设计出PCR引物序列,以N2a细胞的cDNA(100ng/μl)为PCR模板,构建了 OSBP基因过表达质粒。利用脂质体转染试剂LipofectamineTM2000将miR-124a过表达质粒U6-124分别与OSBP过表达质粒OSBP-Cherry、对照质粒pmCherry-N1共转染N2a细胞,用终浓度为20μmol/L的视黄酸诱导分化24h后,用荧光显微镜观察细胞形态。结果显示U6-124质粒和pmCherry-N1质粒共转染的细胞突起长度(n=7,171.15±30.32)高于U6-124质粒和OSBP-Cherry质粒共转染组(n=7,132.09±28.97,P=0.015),差异有统计学意义。说明OSBP基因的过表达能够抑制miR-124a促进神经突起生长的作用,进一步证明OSBP基因具有抑制神经突起生长的作用。为了在原代培养的神经元中,研究OSBP基因对神经突起生长的作用,我们取孕龄为18-19天的C57胎鼠皮层神经元,用电转染方法将OSBP过表达质粒OSBP-Cherry和对照质粒pmCherry-N1分別转染神经元,转染后,用荧光显微镜观察细胞形态。结果显示转染48h 后对照质粒组 pmCherry-N1 的细胞突起长度(n=19,1 12.41±44.87)明显高于 OSBP-Cherry 组(n=15,69.48±23.19,P=0.002),差异有统计学意义,转染后72h和96h也出现类似的结果。说明OSBP基因过表达具有抑制原代培养的神经元突起生长的作用。有研究报道,miR-124a在小鼠大脑发育过程中表达水平有明显的变化,在胚胎期第14天和第17天表达水平较高,在出生后达到平稳并且表达丰富。因此,为了探讨OSBP基因是否在哺乳动物大脑发育中表达发生变化,我们利用实时荧光定量 PCR 法(real-time quantitative RT-PCR,qRT-PCR)检测了 C57小鼠皮层在不同发育阶段的OSBP mRNA表达水平。分别取C57胚胎期小鼠第14天、第18天,出生后第1天、第7天、第30天和第60大小鼠3～4只,提取皮层组织RNA,用qRT-PCR法检测OSBP的mRNA水平。结果显示OSBP mRNA在皮层发育过程中表达量是呈降低趋势的,出生后第1天(n=3,0.66±0.34)与胚胎期第14天(n=3,1.02±0.22,P=0.05)相比有所降低,但是差异无统计学意义,而出生后第7天(n=4,0.52±0.20)比胚胎期第14天(n=3,1.02±0.22,P=0.006)降低显著,并且差异是有统计学意义的,到成年期后表达量较低且处于平稳状态。我们的结果显示在大脑发育过程中,OSBP基因的表达逐渐降低,与miR-124a增高的时间相一致。但是OSBP基因在在体神经元内是否受miR-124a调控,还有待我们进一步研究。综上所述,我们的课题研究发现在N2a细胞分化过程中,miR-124a具有明显的促进神经突起生长的作用。miR-124a可以通过与OSBP基因3’UTR序列结合抑制其表达,所以OSBP可能是miR-124a的直接靶基因。另外,用shRNA抑制OSBP基因的表达能够促进神经突起生长,然而过表达OSBP抑制miR-124a促进神经突起生长的作用。我们进一步研究发现OSBP基因的表达在大脑发育过程中是逐渐降低的。因此,我们的实验结果表明在N2a细胞分化模型中,miR-124a能够通过抑制OSBP基因的表达促进神经突起的生长。在哺乳动物大脑发育过程中,miR-124a是否通过抑制OSBP基因的表达来促进神经突起生长需要进一步研究。